Notch信號通路相關蛋白在腺性膀胱炎和膀胱癌中的表達與意義

黃壯程，王宏浩，沈沛麟，林明恩，何學軍*

（汕頭大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科，廣東汕頭 515041）

泌尿系統最常見的惡性腫瘤是膀胱癌，在常發惡性腫瘤中居第10位，其中超過90%是膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial cell carcinoma，BUC)。膀胱癌首選手術治療聯合術后膀胱灌注治療，由于膀胱癌具有時間上反復發作和空間上多中心性的特點，50%~70%的膀胱癌患者，經治療后5年內復發，并較首發時惡性程度更高[1]。因此，迫切需要從根本上了解膀胱癌的發生和發展機制，為膀胱癌診斷、靶向治療及預后監測提供新方法。

腺性膀胱炎(cystitis glandularis，CG)于1887年由Von Limbberk首次報道，是一種膀胱黏膜增殖性、化生性病變，其病因至今尚未完全明確，多認為與慢性刺激黏膜上皮使其化生為腺性上皮相關[2-3]。目前有認為CG是正常的生理現象，主張保守治療，也有認為CG是癌前病變，建議積極處理[3]。在CG與膀胱腫瘤的關系尚無定論的情況下，如何治療CG存在較大爭議。

Notch信號通路廣泛存在于各種動物細胞的生物學行為中，參與調控細胞增殖、分化和死亡等多個過程，對組織、器官的分化和發育具有重要作用。當Notch信號通路異常激活時，細胞分化異常并可能形成腫瘤[4]。Notch1是該通路的重要受體，Hes1是通路下游重要的轉錄因子，通過分析其表達，可間接反映Notch信號通路的強弱。

本研究采用免疫組織化學(SABC法)技術分別檢測正常膀胱組織、CG和膀胱癌組織中Notch1、Hes1的表達，以探討其在CG形成和腫瘤發展中的作用及意義，并嘗試探討CG與膀胱癌發生的關系，擬為CG以及膀胱癌的預測、診斷、治療、預后、復發監測提供臨床新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

標本收集自2016—2017年汕頭大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科，由臨床經驗豐富的泌尿外科醫師主刀，50例膀胱癌標本均經術后病理確診，其中男39例，女11例；按WHO 2004膀胱癌組織病理學分為：低級別乳頭狀尿路上皮癌15例；高級別乳頭狀尿路上皮癌35例。全部病例術前均無放、化療。收集經術后病理確診的CG組織26例，其中女性21例，男性5例；年齡36～75歲。對照組為16例膀胱正常組織，術前均經患者或家屬同意。所有標本均由本院病理科醫師復核。

1.2 主要試劑

兔抗人Notch1單克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人Hes1單克隆抗體購自美國Abcam公司，DAB顯色試劑盒、PBS緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液均購自博士德生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗步驟 免疫組化采用SABC法。所有組織均經4%多聚甲醛固定、常規取材、脫水、石蠟包埋、4 μm切片，用于HE染色和免疫組化染色。按照SABC法試劑盒說明書操作，DAB顯色后封片，顯微鏡拍照。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 結果判斷 實驗結果使用半定量積分法分析[5]，隨機觀察5個400倍視野，觀察染色質的染色深度并計算著色細胞總數，計算評定結果，見表1。

*由陽性細胞和染色強度記分相乘所得.

1.4 統計分析

使用統計軟件SPSS 22.0處理，采用 χ2檢驗分析兩組間計數資料，檢驗水準 α=0.05。

2 結 果

2.1 Notch1和Hes1在CG和BUC組織中的表達

Notch1和Hes1在BUC、CG組織和膀胱正常組織中均有陽性表達。分析結果顯示，Notch1和Hes1在正常膀胱組織中大部分為陰性表達(評定結果計分為0~1分)，Notch1陽性表達率為25%(4/16)，Hes1為18.75%(3/13)。在BUC組中，Notch1和Hes1表達從陰性到強陽性不等，主要位于胞質及胞核，評定結果計分為0~8 分 ， Notch1陽 性 表 達 率 為70%(30/50)，Hes1為76%(38/50)。而在CG組中，兩者表達結果計分均為0~4 分 ，其中Notch1陽性表達率為65.38%(17/26)，見圖1。BUC和CG組中Notch1、Hes1蛋白表達均較正常膀胱組織高，見表2，差異均有統計學意義(P<0.05)，而CG組和BUC組中兩者之間表達的差異無統計學意義(P>0.05)。Notch1和Hes1在CG和BUC的表達中，隨著膀胱細胞異質性愈明顯，其陽性率愈高。

表2 Notch1和Hes1 在 正常膀胱組織、C G 及 B UC 組織中表達情況

2.2 Notch1和Hes1在BUC組織中的表達與臨床病理指標的關系

Notch1和Hes1表達強度均隨BUC病理分級升高而升高，染色強度亦加深(P<0.05)。且Notch1隨著BUC患者年齡增高陽性表達率升高(P<0.05)，性別對于Notch1和Hes1在CG和BUC組織中的表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

圖1 Notch1和 Hes1 在 正常膀胱組織、 C G 及 BUC組 織中的表達情況(× 4 00)

表3 CG及 B UC 中 N otch1和H es1表達與臨床病理指標的關系

3 討 論

人Notch受體家族包括 N otch1~4共4個成員，配體至今發現有5種：Jagged 1、Jagged 2(Serrate的同系物)、Delta 1、Delta 3和Delta 4(Delta的同系物)。經典的Notch信號通路的激活是Notch配體與受體結合后開始，生成激活形式即胞內區(Notch intracellular domain，NICD)，與細胞核中DNA結合蛋白結合后激活下游靶基因如 H es基 因[6]。在腫瘤的發生與發展中，Notch通路可表現為抑制或激活狀態，從而起到抑癌或促癌作用。

3.1 Notch1與腺性膀胱炎及膀胱癌的關系

本實驗研究發現，Notch1在CG、BUC組織中均有陽性表達，且表達較對照組差異均有統計學上意義，而CG組與 B UC組織之間表達無顯著差異，提示CG與BUC可 能存在相關性。在 B UC中 ，Notch1隨著 B UC病理分級的升高而表達增加，提示Notch1與 B UC侵襲性和轉移可能相關，Notch1異常激活導致 B UC侵襲力增加。據研究統計，Notch1的異常活化出現在10%~15%的頭頸部鱗狀細胞癌中，是第 2常見的突變基因[7]。在膀胱癌中，已有研究[8]表明在高級別膀胱癌中Notch1呈高表達，與本實驗類似。可見Notch1的異常活化常常與腫瘤的發生相關，在CG中也可見Notch1的活化，提示CG亦有類似腫瘤的生物學行為。

3.2 Hes1與腺性膀胱炎及膀胱癌的關系

Hes1是Notch途徑的重要組成成員，主要調節各種細胞生理過程及表觀遺傳，包括細胞分化、周期調控及細胞更新能力，常發揮轉錄抑制因子的作用。在本實驗中，Hes1在正常膀胱組織、膀胱癌組織及CG組織中均存在陽性表達，且與正常膀胱組織間的差異均有統計學意義，而CG與膀胱癌組織中Hes1陽性表達無顯著差異，提示CG與膀胱癌存在相關性。在鼻咽癌中，Hes1通過下調腫瘤抑制因子(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)，促發上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)驅動，促進鼻咽癌的侵襲和轉移[9]。因此我們推測，Hes1作為Notch信號通路的下游靶向因子，在Notch信號通路調節下，參與腫瘤發生、發展，其傳遞Notch信號，促使正常膀胱細胞發生腺上皮化生，維持膀胱腫瘤細胞的未分化狀態，使其處于增殖狀態，并可能介導CG癌變。

3.3 Notch信號通路與腺性膀胱炎及膀胱癌關系

1958年Shaw等首次報道了1例CG患者經過5年轉變為腺癌后，關于CG與膀胱腫瘤的研究越來越多。CG與癌變的關系目前還未肯定。有學者認為它是一種癌前病變。有實驗[10]證明，CG和膀胱癌組織中的CCND1、 C CNA1、 EGFR、 AR、 C X3CL1、 C XCL6、CXCL1等促癌基因的mRNA表達水平顯著高于正常對照組；姚友生等[11]通過觀察分析458例女性CG患者，其中2例CG患者出現腺癌改變。從危險因素上看，CG與膀胱癌均與長期慢性刺激相關，CG有發展成癌的可能。目前來看CG為一種良性病變，但其與膀胱癌相關，而且膀胱腺癌惡性度高、早轉移 、 復發率高，因此進一步確認CG與膀胱癌之間的關系，并嘗試提出診斷及治療CG新方案，對CG的診治有重要的臨床意義。

近年來，越來越多的研究表明，上皮-間質轉化(EMT)在癌癥轉移和侵襲過程中起到關鍵作用。EMT可促使癌細胞增殖、轉移。研究表明，Notch信號通路可通過上調 C DH1基因(編碼E-鈣黏著蛋白)的轉錄抑制因子：SNAI1和SNAI2，從而驅動EMT。在乳腺癌中，Notch信號通路的激活通過上調SNAI2誘導EMT[12]。膀胱癌中已有研究發現Hes1的活性降低時，EMT效應被抑制。因此我們推斷，在CG患者中，由于Notch信號通路的異常活化，激活下游靶基因 H es1，通過下調PTEN或驅動EMT等途徑，導致正常膀胱上皮化生，形成Brunn巢，接著巢中心腺樣化生，形成腺性膀胱炎，在異常活化的Notch信號通路作用下，病變的細胞無法自行修復，對后期CG進展為膀胱癌起到關鍵作用；而在膀胱癌患者中，Notch信號通路的異常激活，不僅維持膀胱癌變細胞存在，使得細胞凋亡能力下降，同時通過增加實體腫瘤內新生血管形成，增加血運，在腫瘤的發展、侵襲與浸潤轉移中發揮關鍵作用。

本實驗結果顯示，Notch1和Hes1在正常組織存在表達，而在膀胱癌和CG組織中存在高表達，且隨著病理分級升高，Notch1和Hes1表達亦增高(P<0.05)，同時我們發現，Notch1和Hes1的陽性表達隨著膀胱細胞異質性的明顯而升高。這些結果表明，Notch信號通路在CG和膀胱癌發生、發展存在并密切相關。有學者認為CG為癌前病變，需要積極處理，我們推測，Notch信號通路在CG發展為膀胱癌過程中起到一定作用，因此我們建議可在CG患者中監測Notch信號通路關鍵因子水平，作為CG診斷及選擇治療方案指標之一。在膀胱癌患者中，我們通過實驗證實Notch1和Hes1的高表達，其可能作為早期監測膀胱癌復發的指標之一。Notch信號通路常與惡性腫瘤預后不良相關，因此，Notch1及Hes1可能作為膀胱癌的預后指標。

綜上，CG的病因尚未完全明確，其與膀胱癌之間是否存在相關尚無定論，若能明確CG與膀胱癌之間的關系，可能為CG診治提供思路。通過本實驗，我們發現Notch1和Hes1可作為CG及膀胱癌早期診斷的敏感指標，對于臨床病理診斷CG并且Notch信號通路異常激活者，建議予以手術治療，并考慮給予膀胱灌注化療及規律隨訪。對于膀胱癌患者，Notch信號通路與其發生、發展密切相關，可作為其診斷、復發監測、預后評估的指標之一。