p53在調控DNA 損傷所致MDA-MB-231細胞死亡中的作用及其機制

姜朋濤，胡志芳，高興春，郭 娜，張 典，姜鳳良*

（西安醫學院基礎醫學部免疫學教研室，西安 710021）

全球乳腺癌占女性癌癥發病總例數的25%，占女性癌癥死亡總例數的15%[1]。中國乳腺癌統計數據雖顯著低于此數值，但是人口基數大，而且發病數和死亡率均逐年上升[2]。所以，乳腺癌嚴重威脅女性的健康，對乳腺癌發病機制的研究具有重大意義。目前乳腺癌發病機制的探索主要集中在癌細胞的存活、增殖、侵襲、轉移機制等多個方面，其中基因組遺傳學改變是其中一個重要的研究方向[3]。基因組遺傳學改變(DNA損傷等)可以自發產生，但是更多見于各種理化因素所致，比如紫外線、電離輻射、某些藥物等。DNA損傷嚴重時可以引起乳腺細胞的死亡，而低劑量的DNA損傷可引起乳腺細胞功能蛋白發生突變導致細胞癌變的發生。p53蛋白是一個重要的DNA損傷修復蛋白，一旦其自發或者誘發產生突變，均會引起細胞癌變[4]。所以，探索DNA損傷及損傷后修復過程中p53等相關蛋白的功能改變對于深入理解乳腺癌的發病機制有重要意義。本文擬初步研究在紫外線照射引起的乳腺癌細胞DNA損傷從而誘導細胞發生輕度死亡過程中乳腺癌細胞基因組遺傳學改變相關的發病機制，這將為治療乳腺癌尋找新靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

MDA-MB-231細胞系購自上海細胞研究所；用于此細胞培養的DMEM高糖培養基和胎牛血清均購自美國Gibco公司。CCK-8細胞增殖試劑盒為日本同仁化學公司產品。剪切PARP抗體(c-PARP，1∶2 000，兔)、p21(1∶ 2 000， 兔 )、 Actin(1∶ 5 000， 鼠 )為 Cell Signaling公司產品；磷酸化p53(p-p53，1∶500，兔)，p53(1∶500，鼠)，磷酸化H2AX(p-H2AX，1∶500，鼠)為Abcam公司產品；NF-90(1∶1 000，鼠)為Santa Cruz公司產品。羊抗鼠-HRP(1∶2 500，115-035-003)和羊抗兔-HRP(1∶2 500，111-035-003)均為美國Jackson Immuno公司產品。

1.2 方法

1.2.1 DNA損傷誘導 本實驗應用短波紫外線(UVC，簡稱UV，100 nm<波長<280 nm)照射誘導DNA損傷。根據紫外線輸出功率計算本實驗所用UVC照射箱為距離光源30 cm處時，照射1 s為1 J/m2。本實驗選擇照射5和20 s時劑量分別為5和20 J/m2，同時設未照射細胞為對照組。照射完成后細胞繼續置于CO2培養箱中孵育相應時間后進行后續實驗。

1.2.2 細胞增殖實驗MDA-MB-231細胞經過不同劑量紫外線(5和20 J/m2)處理后，繼續孵育24 h，按照CCK-8試劑盒說明書的步驟進行檢測，每孔加入10 μL CCK-8后2 h，用全自動酶標儀讀取 D(450)值，檢測不同強度紫外線處理后細胞的增殖情況。

1.2.3 Western blot檢測紫外線處理后不同時間磷酸化H2AX及相關蛋白質的表達水平 由于磷酸化H2AX蛋白是DNA損傷的標志物[5]，通過檢測其表達水平可以反映是否引起了細胞DNA損傷，同時檢測與DNA損傷機制相關的p-p53、 p 53、 NF-90等蛋白。收集5 J/m2紫外線處理后不同時間點(0.5、1、2、4、8、12和24 h)的細胞，用加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解細胞，BCA(bicinchoninic acid)法測定細胞提取上清中的蛋白質濃度。蛋白質上樣量為50 μg，配置SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后轉膜，5%脫脂牛奶孵育2 h后滴加一抗(詳見材料部分)，4 ℃孵育過夜；第2天， 滴 加二抗室溫孵育1 h。常規顯影、定影。應用FIJI 軟件(http://fiji.sc/，基于Image J的圖像分析軟件)對Western blot膠片進行灰度分析，計算相應蛋白的相對表達量[6]。

1.2.4 紫外線處理后不同時間點c-PARP和p21蛋白表達的變化 檢測PARP剪切(c-PARP)水平，可提示DNA損傷的修復功能受到影響的程度，這也是細胞死亡有一定增多的原因。而p21是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase，CDK)家族中的重要成員，p21的表達增加，最終引起細胞周期G1阻滯的發生。為了探究紫外線引起細胞死亡的原因，我們通過Western blot實驗檢測了5 J/m2紫外線處理細胞不同時間點(0.5、1、2、4、8、12和24 h)后c-PARP和p21蛋白表達的變化。Western blot檢測方法同1.2.3。

1.3 統計學分析

用Excel作圖及進行統計學分析。計量數據以x± s表示，兩組間比較采用t檢驗，以α =0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 不同強度紫外線照射對MDA-MB-231細胞增殖的影響

如圖1所示，與對照組(未照射組)比較，5和20 J/m2的UV C照 射MDA-MB-231細胞24 h后，5 J/m2處理組即可以引起細胞死亡增加、增殖減慢(存活率89%，P<0.05)，而當細胞在20 J/m2的紫外線照射后，細胞發生明顯死亡(存活率僅為22%， P<0.01)。由于本文目的為檢測DNA損傷時乳腺癌細胞的保護機制，所以后續實驗將使用引起細胞死亡較溫和的5 J/m2處理細胞。

圖1 不同強度紫外線處理后細胞的存活情況

2.2 紫外線照射引起p-H2AX水平的變化

圖2 為Western blot蛋白免疫印跡法檢測DNA損傷和細胞死亡相關蛋白c-PARP、p-p53、p53、p21、NF-90和p-H2AX結果。圖3所示為p-H2AX與對照組比較的相對表達量，5 J/m2紫外線處理后0.5 h即可引起細胞DNA損傷(p-H2AX)增加(P<0.05)，到2 h后，引起細胞DNA損傷增加非常明顯(P<0.05)，12 h時磷酸化H2AX蛋白達峰值(P<0.05)，直到我們的檢測終點24 h，DNA損傷較12 h時降低，但仍顯著高于對照組(P<0.05)。以上結果說明紫外線處理后DNA損傷非常明顯。

圖2 Westernblot檢 測U VC 處理不同時間后相關蛋白的表達水平

圖3 UVC處 理后不同時間點 p -H2AX蛋白表達的變化

2.3 UVC通過p21-PARP通路引起細胞死亡增加

如圖4A所示，與對照組比較，UVC處理8、12和24 h后c-PARP水平均明顯升高(P<0.05)，這提示細胞發生死亡，DNA損傷的修復功能受到影響。而p21在細胞周期調控和DNA損傷中均發揮著重要作用，它的降解將直接導致細胞DNA修復功能的損傷，與細胞死亡直接有關[7]。圖4B顯示在紫外線處理0.5 h后即開始出現p21的降解，并且p21的表達水平持續偏低(P<0.05)，所以DNA損傷的修復功能受損與p21的快速降解密切相關。

2.4 p53參與調控DNA損傷誘導的細胞死亡

圖4 UVC處 理后不同時間點 c- PARP 和 p21蛋白表達的變化

在p21蛋白持續低水平表達時，乳腺癌細胞并沒有發生細胞大部分死亡。那么，什么因素參與調控這一過程呢？p21是p53重要的下游分子，同時，野生型p53可以參與對p21的調控。所以我們檢測了p53的改變。如圖5A所示，與DNA損傷一致，在處理早期就已經發現DNA損傷相關分子p53的磷酸化增加，在此過程中，p53并未見顯著性變化(圖5B)。由于核因子NF-90與NF-45形成異源二聚體在轉錄和翻譯水平調控p53和p21的表達[8]。所以我們同時對NF-90的表達進行了檢測，結果發現NF-90的表達并無明顯改變，這就提示我們這一過程不依賴于NF-90蛋白量的改變(圖6)。這些結果提示p53并未參與p21降解引起的細胞死亡增多，那么它的增多發揮什么作用及其具體機制仍有待我們進一步研究。

圖5 UVC處理后不同時間點p-p53和p53蛋白表達的變化

3 討 論

乳腺癌的發生、發展與多種因素導致的乳腺細胞DNA損傷修復缺失密切相關，DNA損傷引起細胞周期阻滯后細胞啟動DNA修復過程，這其中包括多種功能蛋白的參與，比如ATM、BRCA-1、p53和PARP-1等[9]。在此過程中任何步驟或分子發生改變均可引起細胞癌變的發生，所以細胞對于DNA損傷后啟動的保護機制需要我們進一步闡明[10]。

本文通過紫外線體外誘導乳腺癌細胞發生DNA損傷，發現在低劑量時雖然有PARP的剪切發生，這一過程與p21的快速降解密切相關，細胞發生少量死亡。p21作為一種細胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制劑，它的表達水平在多種DNA損傷刺激時均可增高，引起細胞阻滯的發生，為DNA損傷的修復提供時間。但是對于其在DNA修復中的作用仍有爭議[11]。有報道發現p21 由于受到DNA損傷從而導致細胞內泛素化降解[12]。本實驗觀察的DNA損傷后p21快速降解(圖4B)也驗證了這一結果。另外，p21在細胞死亡中的作用也存在巨大爭議。一般認為，p53引起p21的表達增加，可以有效抑制細胞死亡的發生，但也有相反的報道，如p21高表達的細胞在UV刺激的時候可以引起p53依賴的細胞死亡增加[13]。總之，p21由于細胞類型、細胞定位、p53狀態和DNA損傷刺激的不同發揮著不同作用[14-15]。本文中我們的實驗結果提示p21的快速降解導致DNA修復功能的缺失，PARP剪切增多，最終導致細胞死亡增加，但是細胞死亡并不十分明顯(與高劑量相比)。那么，在這一過程中抑制細胞死亡的機制是什么呢？

p53是一個重要的抑癌基因，它在DNA損傷修復中也發揮著重要作用[16]。當DNA發生損傷時，p53磷酸化增加，從而導致與鼠雙微粒體(murine double minute 2， M DM2)親和力降低，p53被功能性釋放繼而激活下游DNA損傷修復蛋白，同時它募集下游分子如p21，引起細胞周期發生阻滯，這樣細胞就有足夠的時間對基因組進行修復，如果不能有效修復，p53又可以誘導細胞發生凋亡[17]。但是，由于p53被鑒定出是癌癥中最容易發生突變的蛋白之一，突變導致上述功能的缺失，最終引起細胞癌變的發生[18]。乳腺癌相關的實體瘤或者細胞系中存在多種p53突變，在MDA-MB-231細胞中存在p53 R280K突變，此突變可以參與促進細胞存活的調控[19]，并最終參與抑制DNA損傷對MDAMB-231細胞的死亡誘導作用。綜上所述，結合我們的實驗結果，突變的p53磷酸化增加促進其參與抑制細胞死亡的發生。

同時，我們對p53和p21的調控進行了初步研究。結果顯示NF-90的表達水平并未發生明顯改變。NF-90是剪切體的一個成員，含有雙鏈RNA結合區域，它可以從細胞核轉位到細胞漿結合在p21的3′UTR區從而穩定p21 mRNA[20]。在后續實驗中我們將繼續研究NF-90的轉位對p53和p21的調控，同時我們將研究這一過程中細胞周期及其相關蛋白的作用機制。

由于癌癥細胞中一些DNA修復相關分子多發生結構或者功能的改變，所以基于這些分子研究其靶向治療藥物是腫瘤靶向治療的一個重要方向，多種相關藥物已經被批準上市[21]。p53和p21既參與腫瘤抑制作用，又能通過抑制周期素依賴激酶復合物活性、協調細胞周期、DNA復制與修復之間的關系，促進腫瘤存活，所以它們在不同細胞系，不同刺激狀態作用下所表現的功能改變均可以作為腫瘤藥物個體化治療的靶分子。本研究初步揭示了在乳腺癌細胞系MDA-MB-231中DNA損傷引起細胞死亡及其保護機制，進一步明確了在MDA-MB-231細胞中DNA損傷時p53和p21的改變，為基于p53或者p21的腫瘤治療提供了實驗支持。