食管鱗癌ECA109細胞中Survivin通過ERK信號通路調控c-myc基因表達的機制

閆 冬，吳怡嫻，董娟娟，李秀梅，封 敏*

（1. 新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊830011；2. 新疆醫科大學基礎醫學院，新疆烏魯木齊 830011；3. 新疆醫科大學附屬腫瘤醫院，新疆 烏魯木齊 830000）

食管癌的發生發展是多基因參與、信號傳導調控網絡失調的結果，Survivin、c-myc在多種腫瘤的發生發展中表達上調，但Survivin、c-myc共同高表達的機制并不十分清楚，在前期試驗中我們發現Survivin通過調控核因子(nuclear Factor-κB ，NF-κB)的上游關鍵激酶IKK激酶(IκB kinase)的轉錄而影響NF-κB蛋白的活化狀態[1]，充分說明在腫瘤信號傳導網絡中，Survivin是一個潛在的調控分子。Survivin是目前發現的最強凋亡抑制因子，在正常組織中低表達， c -myc是 原癌基因，其異常擴增及點突變可以促進腫瘤細胞的分裂增值。在哈薩克族食管癌組織中Survivin高表達與cmyc表達正相關， c- myc基 因表達調控與ERK信號通路相關[2]。Survivin調控細胞凋亡和細胞周期的功能研究較為透徹，但其作為一個潛在的轉錄調控因子，在信號通路中的作用并不清楚，鑒于此我們推測Survivin作為潛在的轉錄調控因子，可能對c-myc具有調控作用。故本實驗采用shRNA技術沉默食管癌ECA109細胞中Survivin的表達后觀察c-myc及ERK激酶活化蛋白的表達變化，初步探討Survivin對c-myc的調控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株、引物與試劑

食管癌ECA109細胞系由新疆醫科大學科研中心提供，Survivin短發夾RNA質粒(Survivin shRNA plasmid)、陰性短發夾RNA質粒(control shRNA plasmid)、脂質體轉染試劑(shRNA plasmid transfection reagent)，均購于美國Santa Cruz公司；ERK信號通路阻斷劑PD98059、p38信號通路阻斷劑SB203580、PI3K信號通路阻斷劑LY294002、JNK信號傳導通路特異阻斷劑SP600125、JAK阻斷劑AG490均購于德國Sigma公司，兔抗人Survivin、兔抗人c-myc抗體、羊抗兔IgG抗體均購于武漢博士德公司，PCR擴增引物購于上海生物工程有限公司。PCR引物序列、產物片段長度及退火溫度如表1。

表1 PCR引物序列、產物片段長度及反應條件

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 食管癌ECA109細胞培養于含10%小牛血清以及100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液中，37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱內培養，細胞長至對數生長期用于實驗。

1.2.2 shRNA轉染實驗 分為Survivin shRNA干擾組、陰性質粒對照組、空白細胞株(未加任何處理的食管癌ECA109細胞)，每組設置3個復孔。將2 μg Survivin shRNA plasmid和4 μL shRNA plasmid transfection reagent分別用100 μL無血清DMEM 稀釋，5 min后將稀釋好的Survivin shRNA和shRNA plasmid transfection reagent混勻，室溫放置30 min備用。陰性質粒制備方法同前。將轉染混合物緩慢的逐滴加入食管癌ECA109細胞中，輕輕晃動，放入37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中孵育24 h后，用5 μg/μL的嘌呤霉素篩選細胞株，繼續培養24 h。

1.2.3 細胞總RNA提取、逆轉錄及RT-PCR收集各組細胞，采用Trizol試劑一步法提取總RNA，紫外分光光度計測定其純度。以提取的總RNA為模板，按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄。以得到的cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系為20 μL，其中cDNA模板2 μL，待擴增基因上下引物各1 μL，即用型PCR反應試劑盒反應溶液(2倍濃度)10 μL，雙蒸水6 μL，擴增反應結束后進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像分析。

1.2.4 Western blot檢測 收集細胞、加入RIPA裂解緩沖液，冰上裂解30 min，低溫離心，取上清分裝，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，把蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內，電壓100 V，時間90~120 min。然后轉膜、封閉、一抗孵育(兔抗人Survivin、兔抗人c-myc抗體，1∶400)，二抗孵育(羊抗兔IgG抗體，1∶400)，X光曝光成像，Quantity One軟件分析目標。

1.2.5 信號通路抑制劑的配置及分組 將PD98059、SB203580、LY294002、SP600125、AG490干粉充分溶解于DMSO溶液中，配制成1 mg/mL的儲存液，于-20℃冰箱保存，使用前稀釋成指定的濃度。待細胞生長至匯合度為70%～80%時，更換為含0.1% FBS的1640培養基24 h使細胞同步化，根據分組情況分別加入干預劑，終濃度為50 μmol/L，24 h后收集細胞。

1.3 統計學方法

- 采 用SPSS 16.0統計軟件包進行統計學分析，結果以x± s 表 示，各基因的組間比較采用t 檢驗；基因間表達的相關性分析采用Spearman相關；以 α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 Survivin shRNA干擾后各組Survivin、c-myc mRNA及蛋白的表達

Survivin shRNA轉染48 h，Survivin mRNA及蛋白表達水平明顯下調，與陰性質粒對照組和空白對照組比較差異顯著(P<0.01)；c-myc mRNA及蛋白表達受到抑制，表達下調，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、圖2、表2、表3。

圖1 RT-PCR 法 檢測各組 S urvivin 和 c-myc mRNA 的表達

圖2 Western blot法 檢測各組S urvivin 和 c- myc 蛋白的表達

表2 Survivin shRNA 干 擾后各組S urvivin 和 c-myc mRNA 的表達變化

表3 Survivin shRNA 干 擾后各組S urvivin 和 c-myc 蛋白的表達變化

2.2 信號通路抑制劑處理各組細胞后c-myc的表達

各信號傳導通路特異阻斷劑PD98059、SB203580、 LY294002、 SP600125、 AG490作 用 24 h后，PD98059抑制劑組 c- myc基 因的表達明顯降低，與空白組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。其余各組未見明顯差異。見圖3和表3。

圖3 信 號通路抑制劑干預組 c- myc的表達

表 信號通路抑制劑干預組 的表達

2.3 Survivin shRNA干擾后ERK磷酸化蛋白的表達

Western blot電泳結果顯示，Survivin shRNA轉染后48 h，與空白對照組(1.59±0.28)和陰性質粒對照組(1.63±0.87)比較，p-ERK蛋白磷酸化水平(0.87±0.46)明顯降低，差異顯著(P<0.05)，提示ERK蛋白活化抑制(見圖4)。

圖4 Survivin shRNA 干擾ERK蛋白磷酸化的表達

3 討 論

本課題組前期實驗結果顯示在哈薩克族食管癌組織中Survivin與c-myc表達明顯上調，且二者的表達呈正相關，提示Survivin、c-myc可能協同發揮作用，促進細胞分裂增殖和抑制細胞凋亡。Survivin和c-myc這種協同表達現象也見于其他腫瘤中[3-4]，但機制并不清楚。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種由內源性或外源性的雙鏈RNA分子(double s trand RNA，dsRNA)介導，特異性降解相應序列的mRNA，阻斷或降低同源基因表達，產生相應的功能缺失現象，RNAi是生物界普遍存在的一種調控基因表達的有效方式和鑒定基因功能的重要手段。利用RNAi技術可以容易地確定復雜的信號轉導途徑中相關基因的上下游關系及其作用，因此成為研究細胞信號傳導通路的新途經[5]。我們將Survivin shRNA質粒轉染食管癌細胞株48 h后，Survivin mRNA及蛋白表達下調，c-myc mRNA及蛋白表達明顯降低，提示在食管癌ECA109細胞內Survivin具有調控 c- myc基 因表達的作用。在多種腫瘤組織中Survivin與c-myc表達具有一致性，在腫瘤中可能起協同作用，我們推測高表達的Survivin可通過調控作用激活c-myc表達，而c-myc過度表達可以直接激活CDK4、cyclin D/E/A、細胞分裂周期25A等細胞周期基因的表達，從而促進細胞增殖、分裂[6-7]。采用shRNA技術下調Survivin表達后，其對c-myc激活的作用消失或減弱，從而c-myc的表達也明顯下調，呈現一致性。

ERK通路、JNK通路、p38通路 和 JAK/STAT通路、PI3K通路是目前研究較多的將細胞表面信號轉導至細胞核的信號轉導途徑，這些信號轉導通路激活后都能作用于轉錄因子，調節特定的基因表達。我們采用ERK1/2信號傳導通路特異阻斷劑PD98059、p38信號傳導通路特異阻斷劑SB203580、JNK信號傳導通路特異阻斷劑SP600125、PI3K的特異阻斷劑LY294002，JAK化學阻斷劑AG490分別阻斷了ERK、p38、JNK、PI3K、JAK/STAT信號傳導通路關鍵激酶ERK、p38、JNK、PI3K、STAT3的活化，RT-PCR、Western-blot結果顯示PD98059抑制劑組c-myc mRNA和蛋白的表達降低，與空白細胞組相比差異顯著，提示 c- myc是 ERK信號傳導通路的下游靶基因。ERK通路是MAPK家族的經典轉導通路之一[8-10]，在腫瘤細胞凋亡、分化、侵襲轉移中發揮重要作用。ERK包括ERK1和ERK2兩種異構體，其活性形式是磷酸化ERK(p-ERK)，在受到如細胞因子、生長因子激素、絲裂原受體和缺氧等刺激時，ERK發生磷酸化，并從胞漿移位至細胞核作用于c-myc、AP-1等轉錄因子，促進相關基因的轉錄與表達，從而誘發多種癌基因的相繼激活，導致細胞的惡性轉化，在肝細胞癌的研究中發現[11]上調癌細胞內Ras-ERK通路的磷酸化水平，癌基因 c -myc表 達增加，我們試驗結果再次證實了c-myc的表達受ERK的調控。Survivin對 c- myc這 個癌基因在轉錄及蛋白水平具有正向調控作用，而c-myc的表達受ERK的調控，故我們進一步檢測了Survivin shRNA沉默下調Survivin后ERK磷酸化的蛋白水平，發現p-ERK活化受到抑制，提示Survivin對c-myc的調控作用可能與ERK信號通路有關，ERK蛋白的活化狀態是ERK信號傳導通路中的關鍵點，目前多種腫瘤藥物都是以信號通路中的關鍵激酶為靶點，從而阻斷其誘導的生物學效應。Survivin作為多條信號傳導通路的下游效應分子[12-13]，其高表達導致腫瘤細胞凋亡受到抑制，腫瘤細胞異常增殖，但其作為調控因子的研究并不多見，本實驗發現Survivin的表達可以影響ERK磷酸化水平，提示在基因調控網絡中，基因與信號通路的關系可能不單單是一種單向調節的作用，高表達的Survivin可能通過影響ERK磷酸化水平從而調節其下游靶基因 c-myc的 表達水平。基因調控網絡是一個龐大、作用復雜的系統，我們的研究僅僅證實了Survivin具有影響ERK磷酸化的作用，但其具體作用機制尚待進一步深入研究。