基于Mo/CeO2納米模擬酶的活性抑制檢測(cè)銀離子

焦 雪，劉文昊，馬明建，錢 昊，許曉玲，王瓊丹，吳 慶

(遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 遵義 563000)

0 引 言

重金屬Ag+因具有良好的光、電學(xué)特性被廣泛應(yīng)用于各個(gè)行業(yè)，每年有大量的含Ag+廢水排放到環(huán)境當(dāng)中，成為重金屬污染最嚴(yán)重的離子之一[1-2]。如果人長期暴露在高濃度的銀離子環(huán)境或者通過食物鏈的富集進(jìn)入人體，都會(huì)對(duì)人體造成一定的損害，特別是對(duì)大腦、神經(jīng)及免疫系統(tǒng)的傷害[3]。因此需要建立一種快速、靈敏的傳感器可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)排放廢水及地表水中的Ag+濃度。目前Ag+檢測(cè)常用檢測(cè)方法主要是熒光光譜法[4]、電化學(xué)分析法[5]、原子吸收光譜法[6]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[7]和電感耦合等離子質(zhì)譜法[8]等，但這些方法都存在各自的缺點(diǎn)，如需要大型儀器，前期樣品處理復(fù)雜、耗時(shí)較長、不易攜帶等。近年來，納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展為重金屬離子的檢測(cè)提供了新思路，許多基于納米材料建立起來的檢測(cè)重金屬的化學(xué)生物傳感器被研究報(bào)道[9-11]。如Yang等[12]利用Ag+能和富含C堿基的DNA構(gòu)成特殊的結(jié)構(gòu)而被綠色熒光染料識(shí)別，構(gòu)建了一種簡單快速檢測(cè)Ag+的熒光方法；Hu等[13]通過Ag+能夠加速肽鏈修飾的Au納米顆粒團(tuán)聚的作用，采用比色法簡單快速超靈敏檢測(cè)Ag+。盡管如此，基于納米材料的特殊性質(zhì)開發(fā)的傳感器方法在設(shè)計(jì)和方法靈敏度上需要進(jìn)一步提高。

自2007年，閻錫蘊(yùn)課題組[14]發(fā)現(xiàn)Fe3O4納米材料具有過氧化物模擬酶性質(zhì)之后，許多金屬納米粒子(如貴金屬納米粒子金屬氧化物和碳納米材料[15]等)較好酶的活性被研究。納米材料模擬酶與天然酶相比，能克服天然酶不耐高溫、不耐pH和易于失活等缺點(diǎn)，因此納米材料獲得了廣泛的關(guān)注。近年來，基于納米材料的模擬酶特性建立的檢測(cè)重金屬離子的方法得到了發(fā)展，如Yang等合成了MnO2納米棒并證明該材料具有過氧化物模擬酶的特性，谷胱甘肽能抑制其模擬酶特性使TMB褪色，而Hg2+加入可以使TMB重新顯色，基于此建立了高靈敏檢測(cè)Hg2+的方法；Zhang等制備了rGO/PEI/Pd雜交納米材料，當(dāng)加入Hg2+時(shí)其催化活性增強(qiáng)，建立了快速低檢出限的Hg2+檢測(cè)方法；Song等通過檸檬酸和硼氫化鈉還原制備高分散性的Pt納米粒子，由于其中的檸檬酸可以將Ag+還原成為Ag0，而Ag0又覆蓋到Pt納米粒子上抑制其納米酶催化活性，建立檢測(cè)Ag+的傳感器。

本文通過簡單的微波輔助合成方法制備了具有過氧化物模擬酶特性的Mo/CeO2NPs，當(dāng)Ag+存在時(shí)會(huì)對(duì)其催化活性產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，基于此構(gòu)建了高靈敏的Ag+比色檢測(cè)方法。該方法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便、檢測(cè)快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可潛在應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

T9CS型雙光束子紫外可見分光光度計(jì)（中國惠普有限公司），KM-36C型超聲波清洗機(jī)（廣州市科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），ME204E型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），微波反應(yīng)器（GEM公司），DK-98-11電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），PHS-25型PH指示劑（上海儀電科學(xué)儀器）、硝酸鈰（Ce(NO3)3·6H2O，阿拉丁工業(yè)公司）,鉬酸銨（(NH4)6Mo7O24·4H2O，阿拉丁工業(yè)公司），3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯鹽酸鹽（TMB·2HCl，無水級(jí)，98%，阿拉丁工業(yè)公司）、30%過氧化氫、硝酸銀（AgNO3）、乙酸鈉、冰醋酸、硼酸，所有試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?shí)驗(yàn)用水由NEX UP純水系統(tǒng)(韓國Human公司)制備的超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 mo/CeO2NPs的制備

準(zhǔn)確稱取0.222 4 g (NH4)6Mo7O24·4H2O與0.790 3 g Ce(NO3)3·6H2O置于50 mL燒杯中，加20 mL去離子水溶解，不斷攪拌并緩慢滴加0.1 mol/L的NaOH溶液至pH等于12.0，繼續(xù)攪拌10 min。將溶液放入微波反應(yīng)器，在100 ℃下反應(yīng)4 h。反應(yīng)完成后，離心收集反應(yīng)產(chǎn)物，去離子水洗滌3次。放入真空干燥箱，在80 ℃下干燥6 h。

再分散溶液：上述樣品用瑪瑙研缽研細(xì)，稱取0.002 4 g，加入4 mL去離子水。放入超聲波清洗機(jī)中超聲分散均勻。制得0.6 mg/mL的樣品分散液。

1.3 mo/CeO2NPs模擬酶活性的測(cè)定

以 TMB·2HCl為反應(yīng)底物，測(cè)定 Mo/CeO2NPs的過氧化物模擬酶的性質(zhì)。具體實(shí)驗(yàn)步驟為：依次將2 mL醋酸鈉緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=4.0)、10 μL 0.6 mg/mL 的樣品分散液、100 μL H2O2溶液 (10 mmol/L)、100 μL 的 TMB·2HCl (5 mmol/L)溶液加入到4 mL的Ep管中。在40 ℃下孵育30 min，在652 nm處測(cè)量紫外吸收。

1.4 銀離子的檢測(cè)

于2 mL的Ep管中分別吸取1.7 mL的不同pH的緩沖溶液，然后分別加10 μL Mo/CeO2NPs分散液（0.6 mg/mL），100 μL H2O2溶液（10 mmol/L），100 μL的TMB·2HCl (5 mmol/L)溶液振蕩后，于最優(yōu)溫度45 ℃ 孵育5 min，移取100 μL 的AgNO3(0.25 mmol/L)在45℃下孵育10 min在652 nm處測(cè)紫外吸收。

2 結(jié)果與討論

2.1 mo/CeO2NPs的表征

圖1（a）為Mo/CeO2NPs的X-射線粉末衍射（XRD）圖，該晶體衍射圖與CeO2標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致。該納米材料具有立方螢石結(jié)構(gòu)，但從XRD圖中未發(fā)現(xiàn)其他雜質(zhì)峰，可能是由于摻雜的Mo含量較少，所以在XRD中沒有出現(xiàn)Mo元素的衍射峰。Mo/CeO2NPs的元素分析和電子狀態(tài)可以通過X-射線光電子能譜(XPS)進(jìn)行表征分析，圖1（b）顯示了Mo/CeO2NPs的XPS全譜，在230～238 eV范圍內(nèi)出現(xiàn)了Mo 3d的譜圖，證明通過該方法合成的材料中摻雜有Mo離子。同時(shí)，通過XPS可以獲得Ce的光譜圖，可分為兩個(gè)部分：875～895 eV的峰屬于 Ce 3d5/2和895～910 eV的峰屬于Ce 3d3/2，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。圖2（a）是在最優(yōu)條件下合成的Mo/CeO2NPs的掃描電子顯微鏡(SEM)圖，圖中表明合成的材料呈現(xiàn)不規(guī)則顆粒狀，有少量團(tuán)聚，粒徑尺寸分布不均。為了進(jìn)一步證明該材料由小的納米顆粒形成，通過原子力顯微鏡(AFM)圖（圖2（b））所示，該材料由粒徑大約為25 nm的小顆粒團(tuán)聚而成，表面不光滑，納米材料厚度不均一。

圖1 mo/CeO2NPs的XRD圖和XPS圖

圖2 mo/CeO2NPs的SEM圖和AFM圖

2.2 mo/CeO2NPs的過氧化物酶的特性

為了探究Mo/CeO2NPs的模擬酶活性，以過氧化物酶的底物(TMB·2HCl)為顯色底物，H2O2為氧化底物，Mo/CeO2NPs作為催化劑，考察該體系的顯色反應(yīng)，評(píng)價(jià)其過氧化物模擬酶的催化特性。在0.2 mol/L NaAc緩沖溶液 (pH 4.0)中，Mo/CeO2NPs能夠催化H2O2氧化TMB·2HCl產(chǎn)生經(jīng)典顯色反應(yīng)。氧化TMB在652 nm處有特征吸收峰出現(xiàn)，證明了Mo/CeO2NPs具有類似天然辣根過氧化物酶的活性。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，銀離子可以抑制Mo/CeO2NPs光催化模擬酶的活性，基于此可建立檢測(cè)銀離子的方法，其檢測(cè)原理如圖3所示。Mo/CeO2NPs具有類過氧化物酶活性，可催化TMB· 2HCl與H2O2的顯色反應(yīng)，使溶液呈藍(lán)色。向體系中加入Ag+后，可明顯抑制顯色反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致溶液顏色變淺。基于此建立了Ag+的識(shí)別體系，通過測(cè)量體系紫外-可見吸收光譜的變化定量測(cè)定的Ag+濃度。

圖3 不同反應(yīng)體系的測(cè)定結(jié)果

2.3 體系pH值和溫度對(duì)Mo/CeO2NPs模擬酶催化活性的影響

Mo/CeO2NPs同其他無機(jī)納米材料過氧化物模擬酶和天然酶HRP一樣，其催化活性受體系的pH和溫度的影響。同時(shí)考察加入Ag+后的催化活性受體系的pH和溫度的影響。實(shí)驗(yàn)固定溫度為25 ℃，記錄pH從1.0～12.0變化時(shí)特征吸收峰的變化；再固定pH為4.0，記錄溫度從10 ℃到90 ℃時(shí)的變化。如圖4所示，對(duì)于Mo/CeO2NPs模擬酶來說，當(dāng)pH為4.0和溫度為50 ℃時(shí)，該模擬酶催化活性最大。而相對(duì)于加入Ag+后的抑制體系，考察體系pH和溫度對(duì)于該催化活性抑制的影響，優(yōu)化其最佳pH為4.0，最適溫度為45 ℃。因此，pH為4.0，溫度為45 ℃作為最佳反應(yīng)條件應(yīng)用于接下來的分析檢測(cè)中。

圖4 pH和溫度對(duì)Ag+加入前后體系體系活性的影響

2.4 Ag+的檢測(cè)

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定了不同濃度Ag+存在時(shí)，溶液的吸光度差值與Ag+濃度的關(guān)系圖。如圖5所示，隨著Ag+濃度增大，體系在652 nm處的吸吸收值不斷減小，其吸光度差值逐漸增加，說明Mo/CeO2NPs的催化活性被逐漸抑制，其中插圖為線性關(guān)系圖及不同濃度的比色圖片。通過比色法對(duì) Ag+檢測(cè)線性范圍為1.0×10–7～2.0×10–5mol/L，檢出限為0.9×10–7mol/L。本實(shí)驗(yàn)可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，利用實(shí)驗(yàn)室自來水作為樣品，通過ICPMS檢測(cè)其含量，向樣品中加標(biāo)，使Ag+的濃度達(dá)到5×10–7，1×10–6，2×10–6mol/L，過濾后檢測(cè)。其 3 個(gè)加標(biāo)濃度下的回收率分別為96.8%，98.4%和102.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.6%，5.4%和5.0%。上述結(jié)果表明，利用Mo/CeO2NPs在實(shí)際樣品中檢測(cè)Ag+的方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。本文建立的比色方法簡便快捷，無需復(fù)雜儀器，耗時(shí)短，反應(yīng)條件較溫和，相較于其他檢測(cè)方法具有較好優(yōu)勢(shì)。

圖5 mo/CeO2NPs作為模擬酶檢測(cè)Ag+的響應(yīng)曲線（插圖為線性關(guān)系圖）

2.5 干擾性實(shí)驗(yàn)

考察了幾種可能存在的干擾物質(zhì)，包括以下離子 (Ba2+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cu2+，Mn2+，Ni2+，Pb2+，Zn2+)對(duì)比色測(cè)定Ag+的影響，干擾物質(zhì)的濃度均為Ag+濃度的5倍。 如圖6所示，除Mn2+對(duì)Mo/CeO2NPs的催化活性有輕微抑制作用，其他離子均未引起顯色反應(yīng)明顯的變化，說明本方法具有較好的選擇性。

圖6 不同離子對(duì)比色法測(cè)定Ag+的選擇性影響

3 結(jié)束語

本文采用一種簡單的水熱法合成了具有模擬酶催化活性的Mo/CeO2NPs，考察了Ag+對(duì)Mo/CeO2NPs催化作用的影響。Mo/CeO2NPs催化TMBH2O2的反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物，Ag+可以抑制Mo/CeO2NPs的催化活性，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)現(xiàn)了Ag+的快速、靈敏、選擇性好的比色檢測(cè)。此檢測(cè)體系具有儀器簡單，靈敏度高，檢出限低，方便快速等優(yōu)點(diǎn)。