啤酒中氰化物的快速檢測

伏笑麗，洪霞，袁彩霞，錢瀅文，何海寧，張彥軍，柴宗龍，王杰斌

（甘肅省商業科技研究所，甘肅蘭州730010）

隨著人們生活水平和質量的不斷提高，我國的啤酒工業也隨著發展起來了，啤酒產量有了較大幅度的增長，已成為世界五大啤酒生產國之一[1-3]，2002年至今，全國啤酒年產量超過2 500萬噸，居世界首位[4]。啤酒生產過程中的污染物主要來自空氣、自來水、原料和輔料、接種酵母、設備和管路、包裝材料以及各種用具和操作人員等[5-6]。因此，水中的氰化物已經成為影響啤酒質量的重要因素之一[7]，氰化物不但會污染環境，還會使人、畜中毒甚至死亡，即使像鐵氰酸鹽和亞鐵氰酸鹽那樣的低毒性氰化物復鹽，如果大量排入地面水中，經過陽光照射和其他條件的配合也可以分解釋放出相當數量的游離氰化物，導致水生物的中毒死亡[8-10]。而且氰化物是一類有氰基（CN-）的劇毒化合物，主要指氰酸鹽和氫氰酸，可通過呼吸道、消化道及皮膚進入人體內。

調查發現，啤酒中的污染物主要包括微生物、廢氣物、磷類化合物、氨氮等[11]。管海齊[12]利用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法研究大麥、麥芽、啤酒樣品中赭曲霉毒素，該方法操作簡單、靈敏度高、抗干擾小；高潔等[13]選用基于杯[6]芳烴溶膠-凝膠固相微萃取（solid-phase micro extraction，SPME）萃取頭，建立頂空SPME與氣相色譜聯用檢測啤酒中8種酞酸酯的方法，利用該方法對國內和國外啤酒進行了研究，發現盡管不同酒種的老化物質含量隨時間的延長存在著不同程度的差異，但總體上老化物質的含量會隨著存放時間的延長而增加；李建平等[14]采用超高效液相色譜-串聯質譜多反應監測模式測定啤酒中的4-甲基咪唑的含量，本方法靈敏、快速、準確，可用于啤酒中4-甲基咪唑的測定；張輝珍等[15]利用離子色譜儀測定啤酒中6種無機陰離子的含量，該方法操作簡單、準確度和精密度高，適用于啤酒中無機離子的測定；杜軍良等[16]建立分散液液微萃取-火焰原子吸收光度法測定啤酒中痕量銅的方法，探討了分散劑用量、萃取劑用量、pH值、震蕩時間、絡合劑用量等因素對萃取率的影響，結果發現利用該法測定啤酒中的銅含量令人滿意。但是目前為止，有關啤酒中氰化物含量檢測報道文獻很少。

食品安全是國家和公眾普遍關注的關鍵問題，而氰化物是啤酒產品的一項重要安全檢測指標[17-19]，我國作為酒類產品消費大國，建立一種快速、靈敏、經濟的檢測啤酒中氰化物含量的方法具有重要意義。相關文獻顯示，食品中氰化物的檢測方法主要有分光光度法[20]、氣相色譜法[21]，離子色譜法[22]、氣相-質譜聯用儀法[23]、液相色譜法等[24]。本試驗嘗試采用頂空氣相色譜法測定啤酒樣品中氰化物的含量，將氰化物利用氯胺T衍生劑在磷酸提供的介質中衍生為氯化氰后，直接進頂空氣相色譜法（electron capture detector，ECD）檢測器檢測，樣品不需要蒸餾處理，且省去了傳統方法的蒸餾與手工測定比重等繁瑣操作，數據可靠，干擾小，檢測的靈敏度高，分析速度快，干擾小，實用性強。

1 材料與方法

1.1 儀器

XS 225A-SCS電子天平：普利賽斯國際貿易（上海）有限公司；GENIUS3渦旋振蕩儀：上海右一儀器有限公司；移液管：蘭州百源基因有限公司；吸耳球：蘭州百源基因有限公司；CF16RXⅡ臺式高速離心機：上海東兢電子有限公司；SB-100B超聲波清洗機：甘肅宇豐有限公司；Agilent 7890B頂空氣相色譜儀：德國安捷倫/Agilent Technology。

1.2 試劑

水中氰成分分析標準物質（99.8%）：北京北方偉業計量技術研究院；磷酸（99.8%）：國藥集團化學試劑有限公司；氯胺T（99.3%）：中國計量科學研究院；丙酮（色譜純，99.6%）、正己烷（色譜純，99.6%）：西安市永紅化工原料公司；啤酒樣品：蘭州市城關區同期生產的啤酒；二次蒸餾水。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

氰離子標準系列工作溶液的配制：將購買的水中氰成分分析標準物質配制成10 mg/L儲備液并于冰箱保存，使用時將其儲備液用水稀釋成質量濃度為0、0.001、0.002、0.010、0.050、0.100 mg/L 的標準系列工作溶液。準確移取10 mL標準工作溶液于頂空瓶中，加入0.2 mL（體積分數20%）磷酸溶液，渦流混合，然后加入0.3 mL濃度為10 g/L的氯胺T溶液，立即加蓋密封，渦流混合，取其配制好的溶液于頂空氣相色譜儀進行測定，不同濃度的樣本均重復進樣3次，取測定出的峰面積的均值，依據氰化物含量和其對應的峰面積均值即可繪制出標準曲線圖。

1.3.2 樣品處理

準確移取10.0 mL 15種不同品牌的啤酒試樣于頂空瓶中，加入0.2 mL（體積分數20%）磷酸溶液，渦流混合，然后加入0.3 mL 10 g/L的氯胺T溶液，立即加蓋密封，渦流混合，待測。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱：DB-FFAP（30 m×250 μm×0.25 μm）；進樣口溫度：200℃；檢測器溫度：300℃；升溫程序：40℃（5 min）→50℃/min→200℃（2 min）；氮氣作為載氣，流速2.0 mL/min，純度不低于99.999%；分流比：80∶1。

1.3.4 頂空條件

平衡時間：50 min；加熱箱溫度：55℃；定量環溫度：65℃；傳輸線溫度：100℃。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理的條件選擇

采用的檢測技術是頂空氣相色譜法，溶液的渾濁和顏色都不會對檢測結果造成影響，所以啤酒樣品不需要蒸餾直接取樣進行測定。

2.2 衍生劑用量的選擇

由于氰離子不能直接被氣相色譜檢測，因此，需要經過加入衍生劑處理將其轉化為具有揮發性和穩定性的衍生物，從而實現氣相色譜分析。具體試驗過程如下：利用氯胺T作為衍生劑衍生法反應生成氯化氰衍生物，氯化氰具有沸點低、易揮發的特點，可以滿足頂空氣相色譜進樣檢測。采用頂空氣相色譜技術不僅大大降低了對樣品的前處理操作過程，并且減少了樣品本身可能對分析的干擾或污染，同時頂空分析技術對分析人員和環境危害小、方法重現性好、能實現自動化。

衍生劑氯胺T的用量對檢測結果影響較大，準確移取7份啤酒試樣10 mL于頂空瓶中編號為1、2、3、4、5、6、7，分別加入 20 μL 濃度為 0.01 mg/L 氰離子標準儲備液，再依次添加 50、100、200、300、350、400、500 μL濃度為10 g/L的氯胺T衍生劑溶液，氯胺T的用量對色譜響應值的影響見圖1。

圖1 衍生劑用量的選擇Fig.1 The option of derivatives dosage

由圖1可以看出當氯胺T用量達到300 μL后峰面積達到最大，即可獲得滿意的結果。

2.3 頂空平衡溫度選擇

平衡溫度對樣品氣化過程起著至關重要的作用，頂空氣相色譜選擇平衡溫度為 20、30、40、50、55、60 ℃共6個溫度進行試驗見圖2。

圖2 頂空平衡溫度Fig.2 Headspace equilibrium temperature

由圖2可知，響應值隨著溫度的升高而升高，當溫度達到50℃后變化不大，由于溫度過高會導致進樣的雜質增大，因此，最終選擇55℃為頂空氣相色譜平衡溫度。

2.4 頂空平衡時間的選擇

平衡時間是影響衍生效果的主要因素之一，對啤酒樣品中加入30 μL濃度為0.01 mg/L的氰化物標準溶液后，平衡時間選擇 20、30、35、40、50、55、60、65 min分別進行考察，試驗結果見圖3。

從圖3中可以看出當頂空平衡時間為50 min后即達到穩定，故頂空氣相色譜最終平衡時間選擇為50 min。

圖3 頂空平衡時間Fig.3 Headspace equilibrium time

2.5 衍生pH值的選擇

根據有關文獻顯示，溶液的酸堿性對該衍生有很的大影響，因此可以在頂空瓶中通過加入濃磷酸達到調節pH值的目的，結果見圖4。

圖4 衍生pH值的選擇Fig.4 The option of pH

由圖4可知，通過觀察對色譜響應值的影響，試驗結果表明，峰面積值隨著pH值得增大而增大，當溶液pH值在5.5～6.5范圍內時峰面積沒有明顯差別，所以本方法選用pH值在5.5～6.5作為本試驗衍生條件。

2.6 實際樣品的分析

對15種不同品牌啤酒樣品中的氰化物含量進行測定分析。分別吸取10 mL15種不同品牌啤酒于頂空進樣瓶中，加入0.2 mL磷酸（體積分數20%），渦旋1 min后再加入0.3 mL現配的氯胺T溶液，進頂空氣相色譜儀分析，測定結果見表1。

表1 15種不同品牌啤酒中氰化物含量的測定Table 1 Determination of cyanide content in 15 different brands of beer

續表1 15種不同品牌啤酒中氰化物含量的測定Continue table 1 Determination of cyanide content in 15 different brands of beer

2.7 線性范圍的考察

通過添加回收試驗確定其線性范圍，分別配制氰離子濃度為 0、0.001、0.002、0.005、0.01、0.05、0.1 mg/L系列標準溶液進行氣相色譜測定，以峰面積（Y軸）對氰化物的衍生物的濃度（X軸）繪制標準曲線。得出氰化物在0.001 mg/L～0.1 mg/L范圍內有良好的線性關系，線性方程為：y=19 374.727 3x+17.601 561，相關性系數為0.999 14，檢出限0.000 56 mg/L。在上述條件下，氰離子衍生物的標準曲線圖見圖5。

圖5 氰離子衍生物的標準曲線圖Fig.5 Standard curve of cyanide ion derivatives

2.8 方法的回收率和精密度試驗

選用7號啤酒作為基質，分別加入濃度為0.01mg/L氰離子標準儲備液30 μL和50 μL進行2個濃度水平添加回收試驗，每個添加濃度水平做3個平行樣品。方法的回收率和精密度[用相對標準偏差（RSD）表示]數據見表2。

表2 回收率和精密度Table 2 Recovery and precision

3 結論

試驗采用直接取啤酒樣品加入衍生劑后，采用頂空氣相色譜法檢測啤酒中氰化物含量。該方法操作簡便、快捷，大大縮短了檢測周期，同時對環境沒有什么破壞，是一種環保、經濟、快速的檢測方法，線性關系良好，準確度和精密度較高，抗干擾小。為啤酒制品的質量保證提供了強有力的支持，尤其是面對大批量樣品的檢測，更能體現出方法的優越性。