山核桃粕發(fā)酵醬的研制

郭曉燕，王英臣，2，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101；2.吉林省釀造技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林吉林132101）

山核桃（Carya cathayensis Sarg.）是一種落葉喬木，屬胡桃科。內(nèi)含豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、預(yù)防神經(jīng)退變和提高記憶等功能[1]。但由于山核桃含有一層薄皮，薄皮中含有很多的多酚類物質(zhì)[2]，所以在食用時會有很大的苦澀味，無法將其應(yīng)用于食品，目前只能將其用作飼料，使山核桃粕的再利用受到了很大地限制[3]。

山核桃粕中除去大部分油脂以后，仍含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。其中有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白，經(jīng)過發(fā)酵以后會含有豐富的氨基酸，對人體有益，山核桃粕中還含有豐富的無機(jī)鹽和維生素，例如：鈣、磷、鐵、核黃素、維生素 B6等[2]。

本研究主要采用篩分的方法，來提高山核桃粕中營養(yǎng)物質(zhì)的價值。經(jīng)過發(fā)酵山核桃粕和黃豆，使原料中的氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)溶解出來，加工過程中加入多種微生物菌種進(jìn)行發(fā)酵，會產(chǎn)生豐富的酶系，在多種酶系的作用下生成醇類、酯類、吡嗪、雜環(huán)化合物等呈香物質(zhì)，賦予了醬品更多營養(yǎng)、更好風(fēng)味的特點。并且很好的將山核桃中的優(yōu)質(zhì)蛋白結(jié)合到醬品中，從而將山核桃的功能賦予發(fā)酵醬，使大醬的功能更加廣泛。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

山核桃粕：吉林省樺甸市吉元土產(chǎn)有限公司。

黃豆、面粉、食鹽：市售。

米曲霉（滬釀3.042）、米根霉、黑曲霉、毛霉菌、枯草芽孢桿菌、生香酵母、乳酸菌：山東沂源康源生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海東麓儀器設(shè)備有限公司；ST-02A型100克多功能粉碎機(jī)：上海樹立儀器儀表有限公司；標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩（60、80、100、120、140目）：浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；MJ-250數(shù)顯霉菌培養(yǎng)箱：江蘇省金壇市正基儀器有限公司；CP1502分析天平：上海恒剛儀器儀表有限公司；HH-1水浴鍋：常州市億能實驗儀器場；容量瓶、移液管、堿式滴定管（50 mL）、三角瓶：滄州津玻實驗儀器有限公司；V-5000紫外線分光光度計：上海元析儀器有限公司；ORP800 pH計：武漢吉爾德科技有限公司；鐵架臺：天長市天滬分析儀器有限公司。

2 工藝流程及操作要點

2.1 工藝流程

2.2 操作要點

2.2.1 原料預(yù)處理

1）山核桃的干燥：挑選完整的、沒有被蟲害污染的山核桃粕置于干燥箱中干燥，溫度設(shè)定55℃，時間50 min，除去多余水分，變?yōu)榈S色為止。

2）大豆清洗：選取顆粒完整、無皺皮、表面有光澤的大豆進(jìn)行清洗，除去表面灰塵，后將水瀝干。

2.2.2 破碎

1）山核桃粕的破碎與篩分：將干燥的山核桃粕放入多功能粉碎機(jī)中粉碎，粉碎后過100目篩進(jìn)行篩分，取篩下物過100目篩[4]。

2）大豆的破碎：將瀝干的大豆，放入粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎成粉末狀。

2.2.3 蒸料

將粉碎過篩后的山核桃粕與大豆按質(zhì)量比分別為 4 ∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8 ∶2混合，加入大豆與山核桃粕總量10%的熟面粉[5]。混合好的原料放到電磁爐上進(jìn)行常壓蒸料，在2 200 W下蒸5 min，再換到800 W蒸20 min，至原料熟爛，具有香味即可。

2.2.4 制曲

將米曲霉、黑曲霉、毛霉、枯草芽孢桿菌按2∶1∶1∶1的質(zhì)量比混合[6]，配制成混合菌種，并按0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%的添加量與蒸后冷卻的原料混合，加入總量65%的無菌水，拌勻，捏成蠶豆大的丸曲裝入竹匾內(nèi)平鋪，移入霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別設(shè)置溫度為 20、25、30、35、40℃，保持 80%的濕度。培養(yǎng)18 h左右，曲料上呈現(xiàn)白色菌絲，同時產(chǎn)生曲香。在培養(yǎng)過程中，每隔3小時向紗布上噴灑無菌水，隨時進(jìn)行翻曲以防曲料結(jié)塊，減少通風(fēng)阻力，降低曲料溫度。曲料表面呈新鮮淡黃綠色，內(nèi)部很松散，翻動時有揮飛的孢子，這時制曲完成。

2.2.5 發(fā)酵

將成品丸曲打散，放入土陶制的壇子中，用手按壓實。放置自然升溫，當(dāng)溫度上升至40℃時，進(jìn)行翻醬。當(dāng)溫度持續(xù)上升，將60℃，濃度為14.5°Bé的鹽水按曲的80%、100%、120%、140%、160%加入到原料曲中，等鹽水慢慢滲入其中，在表面撒薄薄一層細(xì)鹽，進(jìn)行封蓋[7]。密封保存，分別維持發(fā)酵溫度為23、26、29、32、35℃，每天檢查2次溫度，進(jìn)行升溫和降溫維持溫度相對穩(wěn)定。發(fā)酵時間設(shè)置為 17、19、21、23、25 d，待丸曲完全被分解成粘稠的半固態(tài)，且測定氨基態(tài)氮含量大于0.5%時，醬醅即成熟[8]，此時補加24°Bé鹽水，翻醬溶解食鹽。

2.2.6 后熟發(fā)酵

放置土陶壇子中進(jìn)行后熟發(fā)酵，溫度控制20℃，時間一個月左右，即山核桃粕發(fā)酵醬發(fā)酵完成，此時醬品口感細(xì)膩，醬香及酯香柔和，具有淡淡的山核桃味。

2.2.7 調(diào)醬、殺菌

成品醬根據(jù)口感、滋味的不同可進(jìn)行調(diào)配。將密封好的已經(jīng)發(fā)酵完成的成品醬，放入85℃的水浴鍋中進(jìn)行殺菌，維持15 min。

2.3 分析檢測方法

2.3.1 樣品處理

1）粗酶液的制備

取10 g成曲于研缽中研細(xì)，后定容至100 mL，在40℃水浴鍋中水浴1 h（用玻璃棒不停攪拌），用紗布過濾獲得濾液。

2）醬樣品的制備

將成品醬攪拌均勻，若有顆粒，可用研缽研細(xì)。取樣品5.0 g，用50mL80℃左右蒸餾水分3次洗入100mL容量瓶中，并加水至刻度，混勻后過濾，濾液即為待測樣品。

2.3.2 曲中蛋白酶活力的測定

采用SB/T10317－1999《蛋白酶活力的測定方法》：福林法進(jìn)行蛋白酶活力的測定[9]。

2.3.3 醬中氨基酸態(tài)氮含量的測定

參照GB/T5009.235－2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測定》酸度計法對成品醬進(jìn)行氨基態(tài)氮含量的測定[10]。

2.3.4 成曲的感官評定

由感官評定小組對成品曲進(jìn)行評分（10分制），將各分值進(jìn)行匯總?cè)∑骄担u分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 成品曲感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria for soy sauce koji

2.3.5 成品醬的感官評定

由感官評定小組對成品發(fā)酵醬進(jìn)行評分（10分制），將各分值進(jìn)行匯總?cè)∑骄担u分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 成品醬的感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria for sauce

續(xù)表2 成品醬的感官評定標(biāo)準(zhǔn)Continue table 2 Sensory evaluation criteria for sauce

3 結(jié)果與分析

3.1 醬曲的制備

3.1.1 山核桃粕添加量對曲的影響

在混合菌種的添加量為0.2%，制曲溫度為30℃的條件下，研究山核桃粕添加量對醬曲的感官和蛋白酶活力的影響，試驗結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 原料質(zhì)量比對曲感官評分的影響Fig.1 The influence of raw material ratio on the sensory evaluation of soy sauce koji

圖2 原料質(zhì)量比對曲蛋白酶活力的影響Fig.2 The influence of raw material ratio on the activity of protease

由圖1可以看出，隨著山核桃粕量的增加，成品曲的感官評價越來越好，試驗中成品曲呈新鮮黃綠色，具有醬香和酯香，質(zhì)地松軟，菌絲均勻生長，當(dāng)原料質(zhì)量比為6∶4時，感官評分最高，繼續(xù)添加山核桃粕，成品曲的顏色變暗，試驗中成品曲體現(xiàn)出異味，通過試驗確定在6∶4的比例時，醬曲感官評分最高。

由此可以看出原料質(zhì)量比在6∶4時，曲的蛋白酶活力達(dá)到最高峰，后隨著原料質(zhì)量比的增大，蛋白酶活力降低。

綜合考慮，選原料質(zhì)量比為 5∶5、6∶4、7∶3作為該因素的3個水平。

3.1.2 混合菌種添加量對曲的影響

在原料質(zhì)量比為6∶4，制曲溫度為30℃的條件下，研究混合菌種的添加量對醬曲的感官和蛋白酶活力的影響，試驗結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 混合菌種的添加量對成曲的影響Fig.3 The influence of the addition of mixed strains on the composition

由圖3可以看出，隨著混合菌種添加量的增加，成品曲的感官評價越來越好，試驗中成品曲呈新鮮黃綠色，具有濃郁的醬香和酯香，曲子酥軟，菌絲深入曲中，當(dāng)混合菌種添加量增加到0.20%時，感官評分最高，隨著混合菌種添加量的繼續(xù)增加，成品曲的顏色變暗，試驗中成品曲體現(xiàn)出異味。

圖4 混合菌種添加量對成曲蛋白酶活力Fig.4 The effect of the addition of mixed strains on the activity of protease

由4圖可以看出，隨著混合菌種添加量的增大，曲中蛋白酶活力增大，在0.20%時蛋白酶活力達(dá)到最高峰。分析其中的原因可能是，不同的菌種之間存在相互抑制，具體的抑制關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

綜合考慮，選擇混合菌種的添加量分別為0.15%、0.20%和0.25%這3個水平進(jìn)行后期正交試驗。

3.1.3 制曲溫度對曲的影響

在混合菌種的添加量為0.2%，原料質(zhì)量比為6∶4的條件下，研究山核桃粕添加量對醬曲的感官和蛋白酶活力的影響，試驗結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 溫度對曲感官評分的影響Fig.5 Influence of temperature on the sensory score of the soy sauce koji

由圖5可以看出，隨著制曲溫度的升高，成品曲的感官評價趨于平和，試驗中成品曲呈新鮮黃綠色，具有醬香和酯香，質(zhì)地松軟，菌絲均勻生長，當(dāng)制曲溫度升高到30℃時，感官評分最高。

圖6 制曲溫度對曲蛋白酶活力的影響Fig.6 The influence of curve temperature on the activity of protease

由圖6可知，曲中蛋白酶活力隨著制曲溫度的升高而增大，曲的蛋白酶活力在35℃時達(dá)到最高峰，之后溫度再升高蛋白酶活力降低。25℃到35℃，這個溫度范圍很適合微生物生長，選擇25、30℃和35℃進(jìn)行正交試驗。

3.1.4 正交試驗

3.1.4.1 正交試驗設(shè)計

根據(jù)2.2.4進(jìn)行制曲工藝的正交試驗，正交試驗的因素水平表見3。

表3 正交試驗因素水平表Table 3 Orthogonal experimental factor level table

3.1.4.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表4。

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal experimental results

從正交試驗結(jié)果可以看出：A2B1C2條件下，蛋白酶活力最高為413 U/g。由極差R可以得出3個因素的主次順序為C>A>B，即溫度對制曲的影響最大，其次是原料質(zhì)量比。在極差分析下，最優(yōu)工藝條件為A2B3C2，即原料質(zhì)量比為6∶4、混合菌種的添加量為0.25%、制曲溫度為30℃。

在A2B3C2確定的工藝條件下對成品曲進(jìn)行感官評定和蛋白酶活力的測定。此時的成品曲呈新鮮黃綠色，具有曲香，質(zhì)地疏松，感官評分為8.2分，評分較高。此時測定的蛋白酶活力為418 U/g，高于A2B1C2工藝條件下的蛋白酶活力。所以，最終確定的工藝為

3.2 山核桃粕發(fā)酵醬的制備

3.2.1 鹽水添加量對成品醬質(zhì)量的影響

在發(fā)酵溫度為29℃，發(fā)酵時間為21 d的條件下，研究食鹽水添加量對發(fā)酵醬的感官和氨基態(tài)氮含量的影響，試驗結(jié)果見圖7、圖8。

圖7 食鹽水添加量對醬感官評分的影響Fig.7 The effects of salt water addition on sensory grading of sauces

由圖7可以看出，隨著食鹽水添加量的增加，成品醬的感官評價越來越好，試驗中成品醬呈棕褐色，具有醬香和酯香，當(dāng)食鹽水的添加量增加到原料曲的120%時，感官評分最高，隨著食鹽水添加量的繼續(xù)增加，成品醬的顏色變深，試驗中成品醬口味咸澀。

圖8 食鹽水添加量對氨基態(tài)氮的含量影響Fig.8 The effects of salt water addition on amino nitrogen content

由圖8可知，隨著食鹽水添加量的增加，氨基態(tài)氮的含量增加，當(dāng)添加量到120%時，氨基態(tài)氮含量最高，達(dá)到1.12 g/100 g，之后隨著食鹽水添加量的繼續(xù)增加，氨基態(tài)氮含量下降。可能是因為食鹽水抑制了菌種的發(fā)酵。

綜合考慮，選擇100%、120%和140%為食鹽水添加量這一因素的3個水平。

3.2.2 發(fā)酵溫度對成品醬質(zhì)量的影響

在食鹽水添加量為120%，發(fā)酵時間為21 d的條件下，研究發(fā)酵溫度對發(fā)酵醬的感官和氨基態(tài)氮含量的影響，試驗結(jié)果見圖9、圖10。

圖9 發(fā)酵溫度對醬感官評分的影響Fig.9 The influence of fermentation temperature on sensory grading of sauces

由圖9可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，成品醬的感官評價越來越好，試驗中成品醬呈棕褐色，具有濃郁的醬香和酯香，當(dāng)發(fā)酵溫度在29℃時，感官評分最高，隨著發(fā)酵溫度的繼續(xù)升高，成品醬的顏色變暗，失去色澤，試驗中成品醬口感較差。

圖10 發(fā)酵溫度對氨基態(tài)氮含量的影響Fig.10 The influence of fermentation temperature on amino nitrogen content

由圖10看出：隨著發(fā)酵溫度的提高，氨基態(tài)氮的含量增加，當(dāng)溫度達(dá)到26℃時，氨基態(tài)氮含量最高，達(dá)到1.03 g/100 g，之后隨著發(fā)酵溫度的繼續(xù)提高，氨基態(tài)氮含量下降。

綜合考慮，選取發(fā)酵溫度為26、29℃和32℃為該因素的3個水平。

3.2.3 發(fā)酵時間的確定

在食鹽水添加量為120%，發(fā)酵時間為21 d的條件下，研究發(fā)酵時間對發(fā)酵醬的感官和氨基態(tài)氮含量的影響，試驗結(jié)果見圖11、圖12。

由圖11可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，成品醬的感官評價越來越好，試驗中成品醬呈棕褐色，具有光澤，并且有濃郁的醬香和酯香，當(dāng)發(fā)酵時間延長到21 d時，感官評分最高，后來隨著發(fā)酵時間的延長，成品醬的顏色變深，感官評分較差。

圖11 發(fā)酵時間對醬感官評分的影響Fig.11 The influence of fermentation time on sensory grading of sauces

圖12 發(fā)酵時間對醬中氨基態(tài)氮含量的影響Fig.12 The influence of fermentation time on the content of amino nitrogen in the sauce

由圖12可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長成品醬的氨基態(tài)氮含量在21 d時達(dá)到最高，之后隨著天數(shù)的延長，氨基態(tài)氮的含量逐漸降低。分析造成這種現(xiàn)象的基本原因：制曲產(chǎn)生了豐富的酶系，在發(fā)酵過程中發(fā)揮了作用，分解了蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，隨著時間的遞增原料中大分子被消耗，而產(chǎn)生醇、酸和酯等產(chǎn)物逐漸積累，會影響醬的品質(zhì)，產(chǎn)生異味，酸敗等現(xiàn)象。

綜合考慮，選擇發(fā)酵時間為19、21 d和23 d為該因素的3個水平。

3.2.4 正交試驗

3.2.4.1 正交試驗設(shè)計

根據(jù)2.2.5進(jìn)行制曲工藝的正交試驗，正交試驗的因素水平表見5。

表5 正交試驗因素水平表Table 5 Table of orthogonal experimental factors

3.2.4.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表6。

表6 正交試驗結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental results

從正交試驗結(jié)果來看：在A3B3C2工藝條件下，氨基態(tài)氮含量為1.46 g/100 g；由極差R可以得出3個因?qū)Π被鶓B(tài)氮含量影響的主次順序為A>B>C，即水料比對氨基態(tài)氮含量的影響最大，其次是溫度。在方差分析下，所得的較優(yōu)工藝條件為A3B2C3，即食鹽水的添加量為曲的140%、發(fā)酵溫度為29℃、制曲時間為23 d。

在A3B2C3工藝條件下，制得成品發(fā)酵醬后進(jìn)行感官評定和氨基態(tài)氮含量的測定。此時的發(fā)酵醬呈棕褐色，具有光澤，還具有濃郁的醬香和酯香，口感細(xì)膩，感官評分為8.6分，感官評分較高。此時測定氨基態(tài)氮含量為1.47 g/100 g，高于A3B3C2條件下的氨基態(tài)氮含量。所以，選擇的較優(yōu)工藝為A3B2C3。

4 結(jié)論

通過研究確定了制曲工藝條件為：山核桃粕粉與黃豆質(zhì)量比為6∶4、混合菌種的添加量為0.25%，制曲溫度為30℃。此時，蛋白酶活力強(qiáng)，分解蛋白質(zhì)的能力強(qiáng)，原料的利用率高。

以山核桃粕為主要原料，采用了多菌種發(fā)酵的方式，制得的具有山核桃風(fēng)味的發(fā)酵醬，增加了通過研究確定了發(fā)酵工藝條件為：添加食鹽水的量為曲料的140%、發(fā)酵溫度為29℃、發(fā)酵23 d。此時，成品醬的氨基態(tài)氮含量高，風(fēng)味物質(zhì)含量高，口感細(xì)膩，醬香及酯香柔和，具有淡淡的山核桃味。