響應面法優化改性制備低溶點、軟凝膠瓊脂

童金華，劉曉婷，安鳳平，黃群，滕慧，宋洪波，*

（1.國家菌草工程技術研究中心，福建福州350002；2.福建農林大學食品科學學院，福建福州350002）

瓊脂，又稱瓊膠、凍粉，是一種從紅藻類海藻中提 取的天然多糖膠體。瓊膠具有優良的凝膠、增稠和穩定性能，可用作增稠劑、凝固劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑、生物培養基和微生物載體，廣泛應用于食品、日用化工、醫藥等領域[1-2]，傳統工藝制備的瓊脂需95℃～100℃溶解成為均一的膠體溶液[1，3]。有別于傳統較高凝膠強度的瓊脂產品，具備低溫溶解、軟凝膠的瓊脂，可廣泛應用于酸奶、冰淇淋、飲料等的生產中[4]，市場需求旺盛。目前該類產品主要依賴進口。

本研究采用螺桿擠壓與羧甲基化相結合對市售瓊脂進行改性，制備低溶點、軟凝膠瓊脂，并使用核磁共振及掃描電鏡技術初步探討改性機理，為生產和應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瓊脂：福建綠新食品有限公司。氯乙酸（分析純）：天津風船化學試劑有限公司；氫氧化鈉、氯化鉀、醋酸、無水乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

DS32-ⅢB型雙螺桿擠壓機：濟南賽信機械有限公司；HH-6型恒溫水浴鍋：金壇市雙捷試驗儀器廠；101-0型鼓風干燥機：上海陽光試驗儀器有限公司；FZl02型微型植物粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；NG1指針型凝膠強度測定儀：中國科學院海洋研究所；BS124S型電子分析天平、TE612-L型電子天平、PB-10 pH計：賽多利斯科學儀器有限公司；ADVANCE III HD 400M型核磁共振儀：瑞士布魯克公司；JSM-6380 LV型掃描電鏡：日本JEOL公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 改性瓊脂制備工藝

預處理：采用螺桿擠壓機預處理瓊脂粉，螺桿擠壓處理工藝條件為：水料比1∶2（mL/g）、溫度115℃、螺桿轉速80 r/min；40℃恒溫干燥24 h，粉碎后過80目篩，得預處理瓊脂粉。

羧甲基化改性：取10.00 g預處理瓊脂粉，加入100 mL不同濃度的乙醇溶液并攪拌使預處理瓊脂粉均勻分散，分別加入4 mL濃度為20%（質量分數）氫氧化鈉溶液至反應體系中至氫氧化鈉濃度為0.8%，35℃水浴保溫1 h；加入一定量的氯乙酸鈉溶液（由氯乙酸與等摩爾比的20%氫氧化鈉水溶液中和得到），以一定溫度反應3 h后，冷卻至室溫；用1 mol/L醋酸調節pH至7.0，抽濾后用相應濃度的乙醇溶液洗滌濾餅3次，收集濾餅；40℃恒溫干燥24 h，粉碎過篩得改性瓊脂粉末[5]。

1.2.2 羧甲基化改性的優化試驗設計

在預試驗基礎上，選擇氯乙酸鈉添加量（A）、羧甲基化反應溫度（B）、乙醇濃度（C）為考察因素，以溶解溫度（Y1）、凝膠強度（Y2）為考察指標，采用響應面法優化羧甲基化改性瓊脂工藝。因素及水平如表1所示。

1.2.3 溶解溫度及凝膠強度測定

用25 mL試管配制1%濃度的膠液于恒溫水浴鍋中進行溶解，設定預估溶解溫度，每30分鐘上調1℃直至溶解，記錄溶解的溫度[6]。

表1 響應面試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels for response surface experiments

凝膠強度測定：將凝膠樣品置于凝膠強度測定儀試樣座上，首先記錄表盤的初始數值；打開開關，記錄凝膠瞬間破裂時表盤的數值，兩個數值之差即為凝膠強度[7]。

1.2.4 核磁共振檢測

將瓊脂置于研缽中研磨，將研磨好的粉末裝入4mm的樣品管。采用核磁共振儀對樣品進行13C-核磁共振（13C-nuclear magnetic resonance，13C-NMR）譜測定。

1.2.5 掃描電鏡測定

將瓊脂粉末粘在導電膠帶上，在真空（真空度為20 Pa）條件下噴金處理，再固定在載物臺上，用LEO1530掃描電子顯微鏡以不同放大倍數對樣品進行觀察，并拍攝照片[8]。

1.2.6 數據處理與分析

優化試驗結果采用Design-Expert 10軟件進行分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 響應面法優化羧甲基化瓊脂

2.1.1 響應面試驗及模型建立

以氯乙酸鈉添加量（A）、羧甲基化反應溫度（B）、乙醇濃度（C）為考察因素，以溶解溫度（Y1）、凝膠強度（Y2）為考察指標，采用響應面法優化羧甲基化改性瓊脂工藝。試驗設計及結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for response surface method

續表2 響應面試驗設計與結果Continue table 2 Experimental design and results for response surface method

對表2中的溶解溫度進行方差分析，結果見表3。

表3 溶解溫度方差分析表Table 3 Variance analysis for solution temperature

對表2中溶解溫度（Y1）與氯乙酸鈉添加量（A）、羧甲基化反應溫度（B）、乙醇濃度（C）擬合得到二次多項式方程如式（1）：

從表3可知，式（1）的顯著性檢驗P<0.000 1，極顯著；失擬項=0.37>0.05，不顯著，表明該型是具有統計學意義。氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應溫度、乙醇濃度的一次項對溶解溫度影響極顯著（P＜0.01），氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應溫度的二次項對溶解溫度影響極顯著（P＜0.01），3個因素的兩兩交互作用的影響均顯著（P＜0.05）。

根據表2試驗結果，對凝膠強度（Y2）與3個因素關系進行擬合得二次多項式方程如式（2）。

表4 是對表2中凝膠強度的方差分析結果。

表4 凝膠強度方差分析表Table 4 Variance analysis for gel strength

由表4可知，方程（2）極顯著。氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應溫度、乙醇濃度的一次項對凝膠強度影響均極顯著，羧甲基化反應溫度、乙醇濃度二次項的影響分別達到顯著和極顯著，氯乙酸鈉添加量和羧甲基化反應溫度交互作用顯著，氯乙酸鈉添加量和乙醇濃度、羧甲基化反應溫度和乙醇濃度交互作用的影響極顯著。

2.1.2 響應面分析

氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應溫度和乙醇濃度與瓊脂溶解溫度及凝膠強度關系的響應面分別如圖1和圖2所示。

從圖1和圖2可以看出，氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應溫度、乙醇濃度3個因素與瓊脂溶解溫度、凝膠強度均呈負相關；3個因素的兩兩交互作用對溶解溫度和凝膠強度的影響均顯著或極顯著，氯乙酸鈉添加量和羧甲基化反應溫度的二次項對溶解溫度的影響極顯著，羧甲基化反應溫度、乙醇濃度的二次項對凝膠強度的影響較顯著，與表3和表4的分析結果一致。

2.1.3 最佳工藝條件確定及驗證試驗

圖1 交互作用對瓊脂溶解溫度的影響Fig.1 Effects of cross-interaction on solution temperature

對于低溶點瓊脂而言，溶解溫度是最重要的考察指標，同時兼顧較低的凝膠強度，因此設定溶解溫度范圍為（52±1）℃、兼顧凝膠強度范圍為55 g/cm2～60 g/cm2，采用方程（1）對羧甲基化改性瓊脂工藝進行優化，優化的工藝參數為：氯乙酸鈉添加量0.027 mol、羧甲基化反應溫度52.5℃、乙醇濃度73.7%，預測的溶解溫度為55.7℃。為了方便操作，調整后的工藝參數為：氯乙酸鈉添加量0.027 mol、羧甲基化反應溫度53.0℃、乙醇濃度74.0%，采用公式（1）預測的溶解溫度為55.7℃，采用公式（2）預測的凝膠強度為58.5 g/cm2；驗證試驗表明，改性瓊脂的溶解溫度為（55.4±0.4）℃、凝膠強度為（58.6±1.2）g/cm2，實際值與模型預測值接近。

與未改性瓊脂溶解溫度為95.2℃、凝膠強度為1 554 g/cm2相比，改性瓊脂的溶解溫度及凝膠強度均大幅度降低，具體優良的低溶點、軟凝膠特性。

2.2 結構表征

根據核磁共振波譜圖中顯示的共振峰的位置、峰的強度及其精細結構，可推算出所測定的物質的結構[9-10]。未改性瓊脂和改性瓊脂的核磁共振圖譜分別如圖3和圖4所示。

圖2 交互作用對瓊脂凝膠強度的影響Fig.2 Effects of cross-interaction on gel strength

圖3 未改性瓊脂核磁共振圖譜Fig.3 13C-NMR spectra of unmodified agar

圖4 改性瓊脂核磁共振圖譜Fig.4 13C-NMR spectra of modified agar

與圖3所示未改性瓊脂13C-NMR圖譜的相比，從圖4改性瓊脂的13C－NMR圖譜觀察到δ=176.3處出現了很微弱的新吸收峰，這是－CH2COO－的羧基基團特征的化學位移，表明改性使得－CH2COO－被引入到瓊脂的分子中[11－12]；改性瓊脂中C－1原子的化學位移向低場移動了4 ppm～5 ppm這說明D－半乳糖單元C－1原子上的羥基發生了羧甲基取代，而原有的結構未遭到破壞。

掃描電鏡（scanning electron microscope）有制樣簡單、圖像分辨率高、放大倍數可調范圍寬、景深大等特點，可以觀察樣品表面細微形態，以便于獲得所測物質細微的結構特征[13－14]。未改性及改性瓊脂的掃描電鏡圖見圖5。

圖5 未改性及改性瓊脂的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscopy figures of unmodified and modified agar

如圖5所示，未改性瓊脂顆粒表面較為光滑且平整，顆粒呈片狀；改性瓊脂顆粒為不規則的塊狀且表面粗糙，呈現較多不規則斷裂面。由于經螺桿擠壓后羧甲基改性，使得瓊脂顆粒形態一定程度破壞，顆粒表面積增大，因此更有利于改性瓊脂吸水膨脹和溶解。

3 結論

1）經螺桿擠壓預處理后進行羧甲基化改性瓊脂，優化的羧甲基化工藝參數為：氯乙酸鈉添加量0.027mol、羧甲基化反應溫度53.0℃、乙醇濃度74%，制備的改性瓊脂的溶解溫度為55.4℃、凝膠強度為58.6 g/cm2，表現出優良的低溫溶解和軟凝膠性能。

2）核磁共振分析表明經改性的瓊脂，羧甲基官能團被成功引入到瓊脂的糖單元結構中，但原有結構未破壞；掃描電鏡觀察表明改性使得瓊脂顆粒受到一定程度破壞，顆粒表面積增大；這些化學及物理結構的變化，為良好的低溶點、軟凝膠性能提供了保障。