大孔樹脂分離純化羅勒葉總黃酮及抗氧化活性研究

（洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與檢驗(yàn)系，河南洛陽471000）

羅勒（Ocimum basilicum L.）屬于唇形科羅勒屬，藥 食兩用芳香植物，全國各地均有種植[1]。羅勒含有豐富的黃酮化合物和香豆素[2]，其作為次生代謝產(chǎn)物，具有抗癌、抗衰老和抗氧化作用[3]，因此對羅勒中黃酮進(jìn)行研究，有助于明確羅勒的營養(yǎng)價(jià)值。目前已有部分文獻(xiàn)報(bào)道了羅勒中黃酮的提取工藝的研究，但富集純化工藝報(bào)道較少[4－5]。本試驗(yàn)以羅勒總黃酮粗提物為原料，選用最佳大孔樹脂純化羅勒總黃酮通過大孔樹脂靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附解吸試驗(yàn)優(yōu)化大孔樹脂工藝條件，并考察了羅勒總黃酮對1－二苯基－2－三硝基苯肼（1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl radical，DPPH） 和 2'－聯(lián)氨－雙－3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸 [2，2'－azino－bis（3－ethylbenzothiazoline－6－sulfonic acid），ABTS]自由基的清除能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅勒購自于河南省漯河市中醫(yī)院，60℃烘干，粉碎后過60目篩，備用。

標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁：中國藥品生物制品檢定所；DPPH、ABTS：美國sigma公司；其他試劑均為分析純；D101、AB－8、D3520、NKA－9、S－8、X－5、HPD－100、HPD－300：滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE－52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HH－4型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；SHA－CA型水浴恒溫振蕩器：金壇市宏華儀器廠；AE240型電子天平：瑞士梅特勒－托利多公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羅勒總黃酮提取液的制備

稱取粉碎后的羅勒葉，以料液比 1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、70℃、超聲功率170 W，超聲輔助提取1 h，提取3次，合并濾液，40℃條件下減壓濃縮，濃縮液冷凍干燥（＜20 Pa，－40℃，48 h）備用。

1.3.2 羅勒中總黃酮測定

采用紫外分光光度法測定，選擇蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，NaNO2－Al（NO）3－NaOH為顯色劑，參照文獻(xiàn)[6－7]稍作改進(jìn)，回歸分析得 A=10.954 3C+0.004 3，r=0.999 8，線性范圍 0～0.257 mg/mL[C：蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL），A：波長510 nm吸光度值]。

1.3.3 大孔樹脂預(yù)處理

去離子水洗去破碎樹脂和雜質(zhì)，95%乙醇浸泡24 h，去離子水洗滌無白色渾濁，且無醇味。濕法上柱（Ф30 mm×360 mm），4 BV 5%NaOH 3 BV/h流速過柱，去離子水洗至中性，4 BV 2%HCl 3 BV/h流速過柱，去離子水洗至中性，70℃烘干至質(zhì)量恒定。

1.3.4 大孔樹脂的靜態(tài)吸附、解吸試驗(yàn)

1.3.4.1 大孔樹脂優(yōu)選

稱取預(yù)處理的大孔樹脂各1 g于100 mL錐形瓶中，加入 30 mL（V0）濃度（C0）為 2.56 mg/mL，振蕩吸附（100 r/min，30℃）24 h后，測定平衡液中總黃酮濃度（C1）。將吸附飽和的樹脂加入75%乙醇30 mL，振蕩（90 r/min，30℃）解析 24 h，過濾并檢測濾液（V1）中黃酮濃度（C2）。其中靜態(tài)吸附量 Q（mg/g）=（C0－C1）×V0/M，吸附率/%=（C0－C1）/C0。靜態(tài)解吸率/%=（C2×V2）/（M×Q）×100。回收率/%=（C2×V2）×100/C0×V0[8－9]。

1.3.4.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)

稱取預(yù)處理的大孔樹脂各1 g于100 mL錐形瓶中，參照“1.3.4.1”法，振蕩吸附（100 r/min，30℃），分別于 0.5、1、2、4、6、8、10、15、24 h 檢測平衡液中液總黃酮濃度，繪制“1.3.4.1”優(yōu)選最佳樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.4.3 最佳上樣液濃度的確定

稱取預(yù)處理的大孔樹脂各1 g于100 mL錐形瓶中，加入質(zhì)量濃度分別為 4.56、3.56、2.56、1.56、0.78、0.39 mg/mL的上樣液各30 mL，振蕩吸附（100 r/min，30℃）24h后，測定平衡液中總黃酮濃度，計(jì)算吸附率。

1.3.4.4 上樣液的pH值的確定

稱取預(yù)處理的大孔樹脂各1 g于100 mL錐形瓶中，加入質(zhì)量濃度為2.56 mg/mL的上樣液30 mL，分別采用1 mol/L NaOH和1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為2、3、4、5、6、7、8、9 振蕩吸附（100 r/min，30 ℃）24 h 后，測定平衡液中總黃酮濃度，計(jì)算吸附率。

1.3.4.5 解吸液濃度的確定

將吸附飽和的樹脂去除殘液，加入體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液各 30 mL，振蕩（90 r/min，30℃）解吸 24 h，過濾并檢測濾液中黃酮濃度，計(jì)算解吸率。

1.3.4.6 解吸液pH值的確定

將吸附飽和的樹脂去除殘液，加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液30mL，分別采用1mol/LNaOH和1mol/L鹽酸調(diào)節(jié) pH 值為 2、3、4、5、6、7、8、9，振蕩（90 r/min，30℃）解吸24 h，過濾并檢測濾液中黃酮濃度，計(jì)算解吸率。

1.3.5 大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附、解吸試驗(yàn)

1.3.5.1 最佳上樣流速和上樣體積的確定

大孔樹脂濕法裝柱，量取優(yōu)選的大孔樹脂25 mL裝柱（Ф16 mm×480 mm），2.56 mg/mL羅勒總黃酮溶液，分別以 1、2、3、4 BV/h 流速上樣，以每 8 毫升為一組收集過柱液，測定過柱液總黃酮濃度，繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線，尋找泄漏點(diǎn)。

1.3.5.2 洗脫劑流速和洗脫體積的確定

采用優(yōu)化工藝裝柱、上樣，去離子水沖洗至無色，80%乙醇以1、2、3、4BV/h的流速洗脫，以每 8毫升為一組收集洗脫液，測定總黃酮濃度，繪制動(dòng)態(tài)洗脫曲線。

1.3.6 羅勒總黃酮體外抗氧化作用研究

1.3.6.1 DPPH自由基的清除率

準(zhǔn)確吸取2 mL待測液于試管中，加入2 mL DPPH乙醇溶液（0.5 mmol/L），搖勻、靜置 30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清于波長517 nm測定吸光度（As），同時(shí)測定只加乙醇的DPPH溶液吸光度（Ac）；計(jì)算DPPH自由基的清除率，其中DPPH自由基清除率/%＝（AC－AS）/AC× 100[10－11]。

1.3.6.2 ABTS+自由基的清除率的測定

7 mmol/LABTS溶液和2.45 mmol/L K2S2O8溶液各20 mL混合均勻，避光靜置16 h；乙醇稀釋至吸光度為0.70±0.02（波長734 nm）。準(zhǔn)確吸取待測液0.15 mL于2.85 mL ABTS溶液中，混勻，30 min后于波長734 nm處測定吸光度（As）。同時(shí)測定只加乙醇的ABTS溶液吸光度（Ac）；計(jì)算 ABTS+自由基清除率，其中 ABTS+自由基清除率/%=（AC－AS）/AC×100[12－13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸分析見表1。

表1 大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸分析Table 1 Static adsorption and desorption analysis of macroporous resin

由表1可知，X－5、AB－8等樹脂的吸附率較高，吸附率分別為（85.42±0.73）%、（81.54±0.59）%，解吸率分別為（90.21±0.87）%、（82.46±0.73）%，但 AB－8 回收率低于X－5。綜合分析，選擇X－5進(jìn)行靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)研究。

2.2 X－5靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)

X－5靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)圖見圖1。

圖1 X-5靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)Fig.1 X-5 static adsorption kinetics

圖1顯示，伴隨時(shí)間的推移，X－5大孔樹脂對羅勒黃酮的吸附率呈現(xiàn)增加趨勢，吸附3 h后，吸附率趨于穩(wěn)定，基本達(dá)到吸附平衡。

2.3 上樣液濃度的影響

上樣液濃度對X－5大孔樹脂吸附的影響見圖2。

圖2 上樣液濃度對X-5大孔樹脂吸附的影響Fig.2 Effect of the concentration of the sample solution on theadsorption of X-5 macroporous resin

圖2所示，伴隨上樣濃度的增加，X－5大孔樹脂對羅勒黃酮的吸附率呈現(xiàn)增加趨勢，當(dāng)濃度大于2.56 mg/mL時(shí)，X－5大孔樹脂吸附率增加趨緩。一方面可能是上樣液濃度過低，純化時(shí)間過長，另一方面濃度過高，大孔樹脂吸附不充分[14－15]。因此選擇2.56 mg/mL為最佳上樣濃度。

2.4 上樣液的pH值的確定

上樣液pH值對X－5大孔樹脂吸附的影響見圖3。

圖3顯示，上樣液pH值為4時(shí)吸附率最大，可能是pH值過低，易形成烊鹽，pH值過高，黃酮以離子狀態(tài)存在[16－17]。兩種狀態(tài)均影響樹脂對黃酮的吸附。因此上樣液pH值選擇4。

圖3 上樣液pH值對X-5大孔樹脂吸附的影響Fig.3 Effect of pH of the sample solution on the adsorption of X-5 macroporous resin

2.5 洗脫劑乙醇濃度的考察

解吸液pH值對X-5大孔樹脂解吸的影響見圖4。

圖4 解吸液pH值對X-5大孔樹脂解吸的影響Fig.4 Effect of pH of desorbent on desorption of X-5 macroporous resin

由圖4可知，伴隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃酮解吸率呈現(xiàn)增加趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，解吸率最高。繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，解吸率變化不明顯。因此選擇70%的乙醇為解吸液。

2.6 洗脫劑pH的考察

解吸液pH值對X-5大孔樹脂解吸的影響見圖5。

圖5 解吸液pH值對X-5大孔樹脂解吸的影響Fig.5 Effect of pH of desorbent on desorption of X-5 macroporous resin

由圖5可知，伴隨解吸液pH值的增加，解吸率呈現(xiàn)增加趨勢，pH值達(dá)到6時(shí)，解吸率最高。繼續(xù)增加pH，解吸率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，可能與黃酮本身為弱酸性有關(guān)[18-19]。因此選擇解吸液pH值為6。

2.7 動(dòng)態(tài)吸附和解吸

2.7.1 上樣流速和上樣體積的確定

泄漏曲線見圖6。

圖6 泄漏曲線Fig.6 Leakage curve

由圖6可知，流速1 BV/h時(shí)，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)較遲（72 mL），而流速為3BV/h時(shí)，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)較快（40mL），而流速為2 BV/h時(shí)，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)間居中（56 mL）。可能是流速慢，有利于樹脂對黃酮的吸附，但不經(jīng)濟(jì)。而流速過快，樣品在樹脂中停留時(shí)間短，吸附效率較差。因此，選擇2 BV/h為理想流速。同時(shí)結(jié)合泄漏曲線，選擇上樣體積為56 mL。

2.7.2 洗脫劑流速的確定

洗脫流速對洗脫效果的影響圖見圖7。

圖7 洗脫流速對洗脫效果的影響Fig.7 Effect of elution flow rate on elution efficiency

圖7顯示，伴隨洗脫流速增加，黃酮解吸率明顯下降。但流速過低，經(jīng)濟(jì)效益較差，過快洗脫效果不明顯[20]。因此，洗脫流速控制在2 BV/h。

2.7.3 洗脫體積的考察

黃酮?jiǎng)討B(tài)洗脫曲線圖見圖8。

圖8顯示，伴隨洗脫體積的增加，解吸液的黃酮的濃度也在增加，當(dāng)洗脫體積為64 mL時(shí)，洗脫液中的黃酮質(zhì)量濃度基本無變化。因此確定64 mL為最大洗脫體積。

圖8 黃酮?jiǎng)討B(tài)洗脫曲線Fig.8 Flavonoid dynamic elution curve

2.8 工藝驗(yàn)證

按“1.3.1”法得粗提總黃酮純度為21.38%，按照最佳純化工藝得黃酮的純度為69.36%，精制倍數(shù)為69.36%/21.38%=3.24。

2.9 羅勒總黃酮抗氧化效果研究

羅勒總黃酮對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除作用圖見圖9。

圖9 羅勒總黃酮對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effects of total flavonoids from Ocimum basilicum L.on DPPH free radicals and ABTS+free radicals

由圖9可知，羅勒總黃酮對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除效果呈現(xiàn)明顯劑量依賴性，通過半數(shù)清除率IC50值[8]比較發(fā)現(xiàn)，粗黃銅對DPPH自由基和ABTS+自由基半數(shù)清除率IC50值分別為1.06 mg/mL和1.717 mg/mL，明顯高于純化后黃酮的0.215 mg/mL和0.544 mg/mL。

3 結(jié)論

本研究通過大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)優(yōu)選X-5為純化羅勒總黃酮最佳樹脂。并通過靜態(tài)吸附、解吸及動(dòng)態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)確定最佳工藝：上樣液濃度2.56 mg/mL，上樣流速為2 BV/h，pH為 4，上樣體積56 mL，以pH為6的70%乙醇在流速2 BV/h下洗脫，得黃酮的純度為68.36%，精制倍數(shù)為3.24。純化后黃酮的對DPPH和ABTS+自由基半數(shù)清除率IC50值分別為0.215 mg/mL和0.544 mg/mL，明顯高于粗黃銅的1.06 mg/mL和1.717 mg/mL。