蘆筍總皂苷的提取純化及抗氧化研究

葛思琪，趙慶生，孫廣利，趙兵，陳哲，黃云祥，查圣華

（1.北京城市學(xué)院，北京100094；2.中國科學(xué)院過程工程研究所，北京100090；3.河北省蘆筍產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北省蘆筍工程技術(shù)研究中心，河北秦皇島066000）

蘆筍（Asparagus officinalis L.），學(xué)名石刁柏，別名龍須菜、文山竹。蘆筍為天門冬科天門冬屬多年生宿根草本植物，原產(chǎn)地為歐洲的地中海東岸以及小亞細(xì)亞一帶[1]，19世紀(jì)末20世紀(jì)初傳入我國[2]。蘆筍，性味涼，甘、苦。具有潤肺鎮(zhèn)咳，祛痰殺蟲的功效。據(jù)《中藥大辭典》記載，蘆筍的塊根入藥，利尿，可降低腎小管的再吸收[1]。醫(yī)學(xué)巨著《本草綱目》把蘆筍列為上品，并對它的藥用價值作了詳細(xì)闡述。近幾年來，蘆筍作為藥食兩用的保健型蔬菜，因其眾多的藥用價值與營養(yǎng)價值而廣受歡迎。蘆筍中含大量皂苷、黃酮、多糖等成分，具有抗癌[3-4]、提高機(jī)體免疫力[5-6]、降血脂[7-8]、抗衰老[9-10]以及抗疲勞[11-12]、護(hù)肝[13-14]、抗?jié)僛15-16]、殺菌鎮(zhèn)痛[17]等作用。李翠霞等測定了蘆筍與其他日常蔬菜的營養(yǎng)成分，并進(jìn)行對比。結(jié)果表明，蘆筍含有較高的營養(yǎng)成分，此外還含有豐富的維生素和礦物質(zhì)元素，其中Fe、Mg、Zn、Ca 等元素含量較高于其他蔬菜[18]。

蘆筍皂苷是蘆筍中的重要活性成分之一，蘆筍皂苷具有較明顯的抗氧化活性，可以考慮將其開發(fā)成為新型的抗氧化藥劑[19]。但是市場上未見有蘆筍皂苷為主要成分的藥物和保健品在售，其主要原因是皂苷含量達(dá)不到要求。本文從蘆筍總皂苷的提取、純化及蘆筍總皂苷的抗氧化活性這3個方面對蘆筍總皂苷做了系統(tǒng)地研究，為進(jìn)一步研究與開發(fā)利用蘆筍總皂苷提供了線索和依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 原料

蘆筍：由秦皇島長勝營養(yǎng)健康科技有限公司提供，干燥后用粉碎機(jī)粉碎，過10目篩，備用。

1.2 試驗(yàn)試劑

菝葜皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品（純度為95%）：索萊寶科技有限公司；無水乙醇、石油醚、正丁醇：北京化工廠；冰醋酸：北京市通廣精細(xì)化工公司；高氯酸：天津市鑫源化工有限公司；香蘭素：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上所以試劑均為分析純。DPPH、ABTS：阿拉丁試劑上海有限公司；抗壞血酸：西隴化工股份有限公司，以上所有試劑均為分析純；HPD-100大孔吸附樹脂：天津南開大學(xué)化學(xué)工廠。

1.3 試驗(yàn)儀器

DFT-150粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；VB540 10目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩：上虞縣儀器紗篩廠；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；2802紫外可見分光光度計(jì)：尤尼克（上海）儀器有限公司；DF-101S水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 總皂苷測定方法

2.1.1 菝葜皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

精密稱取菝葜皂苷元5 mg，用甲醇定容至5 mL。分別配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL 的梯度溶液。精密吸取400 μL不同濃度的菝葜皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品，70℃水浴揮干溶劑。配制5%的香草醛-冰醋酸溶液（0.5 g香草醛，用冰醋酸定容至10 mL），加入5%的香草醛-冰醋酸溶液 200 μL，高氯酸 800 μL，70 ℃水浴 15 min，取出后冷卻至室溫。加入5 mL冰醋酸，在400 nm～800 nm下進(jìn)行全波長掃描，確定最大吸收波長。

2.1.2 總皂苷含量測定

根據(jù)上述方法確定的檢測波長進(jìn)行總皂苷含量測定。提取液皂苷含量測定用移液槍吸取一定體積的提取液，按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定樣品提取液的吸光值，以不加提取液為空白對照，計(jì)算提取液中的蘆筍總皂苷含量。

2.2 提取工藝

將新鮮蘆筍樣品洗凈，切斷，于40℃～60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，用粉碎機(jī)粉碎并過10目篩，密封保存?zhèn)溆谩７Q取一定量的蘆筍粉末，研究不同提取時間、提取溫度、料液比以及乙醇濃度等試驗(yàn)條件對蘆筍總皂苷提取率的影響。精密稱取一定質(zhì)量的蘆筍粉末，置于圓底燒瓶中，加入一定濃度的乙醇適量，在一定的水浴條件下進(jìn)行回流提取，離心過濾。將粗提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，干燥至恒重。

提取率計(jì)算公式如下：提取率/%=蘆筍粗提物中總皂苷重量/蘆筍原料總重量×100

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 乙醇濃度對蘆筍總皂苷提取率的影響

稱取蘆筍粉末，在提取溫度為80℃，料液比1∶40（g/mL）的條件下，分別以 50%、60%、70%、80%和90%的乙醇濃度提取1.5 h，考察不同乙醇濃度對蘆筍總皂苷的提取率的影響。

2.2.1.2 料液比對蘆筍總皂苷提取率的影響

稱取蘆筍粉末，在提取溫度為80℃，乙醇濃度為70%的條件下，分別以 1∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1∶40（g/mL）的料液比（蘆筍粉末質(zhì)量∶乙醇溶液體積）提取1.5 h，考察不同料液比對蘆筍總皂苷的提取率的影響。

2.2.1.3 提取溫度對蘆筍總皂苷提取率的影響

稱取蘆筍粉末，在料液比為 1∶35（g/mL），乙醇濃度為70%的條件下，分別于60、70、80、90℃和100℃下提取1.5 h，考察不同提取溫度對蘆筍總皂苷的提取率的影響。

2.2.1.4 提取時間對蘆筍總皂苷提取率的影響

稱取蘆筍粉末，在溫度為80℃，料液比為1∶35（g/mL），乙醇濃度為 70%的條件下，分別提取 0.5、1、1.5、2 h和2.5 h，考察不同提取時間對蘆筍總皂苷的提取率的影響。

2.2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）和提取溫度（D）4個因素，每個因素設(shè)3個水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)表。對所得試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，確定最佳工藝條件。正交因素水平表見表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

2.3 純化工藝

2.3.1 萃取法

依次使用石油醚與水飽和正丁醇萃取4次。

2.3.2 大孔樹脂除雜

2.3.2.1 樹脂的預(yù)處理

稱取一定量的HPD-100大孔吸附樹脂，先用無水乙醇充分浸泡，濕法裝柱，用95%乙醇洗脫，至流出液加4倍量的純水沖洗至流出液不變渾濁為止。再用純水洗盡柱內(nèi)乙醇，作為濕樹脂，備用。

2.3.2.2 乙醇洗脫梯度的選擇

萃取后的提取物溶液緩慢上樣至HPD-100大孔吸附樹脂柱中，依次用4倍柱體積（BV）、體積分?jǐn)?shù)為0%、20%、50%、80%、95%的乙醇水溶液過柱，收集各洗脫液，分別測定各洗脫液的皂苷含量、固形物含量。

2.3.2.3 洗脫劑用量的確定

萃取后的提取物溶液緩慢上樣至HPD-100大孔吸附樹脂柱中，依次用0%、20%、50%、80%、95%的乙醇洗脫。以1 BV/份收集流份。測定各流份中固形物含量和蘆筍總皂苷的含量。

2.4 抗氧化活性的測定

2.4.1 DPPH法測定抗氧化活性

DPPH自由基清除能力：配制0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液（精密稱取2 mg DPPH使用無水乙醇定容至50 mL）。取1 mL不同濃度的各樣品，加入1 mL DPPH乙醇溶液，混勻，在室溫下于暗處靜置30 min，于517 nm處測定吸光值。使用抗壞血酸作為陽性對照。DPPH自由基清除率RDPPH用以下公式計(jì)算：

式中：A0為以水代替樣品作為空白對照測得的吸光值；Ai為各樣品測定所得吸光值；Aj為以水代替DPPH乙醇溶液時各樣品所測得的吸光值。

2.4.2 ABTS法測定抗氧化活性

取 50 mL ABTS溶液（7 mmol/L）和 880 μL過硫酸鉀溶液（140 mmol/L）混合，于室溫下在暗處反應(yīng)24 h形成ABTS儲備液，使用前用蒸餾水稀釋80倍（至測樣時空白對照在734 nm處的吸光值為0.7±0.02）作為ABTS工作液。樣品用蒸餾水稀釋成不同濃度，取1 mL樣品溶液與4 mL ABTS工作液混合，振蕩30 s，在室溫下于暗處反應(yīng)6 min后，于734 nm處測定吸光值。使用抗壞血酸作為陽性對照。ABTS+自由基清除率RABTS用如下公式計(jì)算：

式中：A0為以水代替樣品溶液測得吸光值，Ai為各樣品溶液測定所得吸光值，Aj為以水代替ABTS溶液時各樣品所測得的吸光值。

2.5 數(shù)據(jù)分析方法

研究數(shù)據(jù)（3次數(shù)據(jù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）采用Excel 2007制圖及SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 菝葜皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

菝葜皂苷元經(jīng)香草醛-冰醋酸顯色后在400 nm～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，光譜掃描曲線如圖1所示。

圖1 菝葜皂苷元的全波長掃描圖Fig.1 Whole wavelength scan of sarsaparilla saponin determination

由圖1結(jié)果發(fā)現(xiàn)在527 nm處有最大吸收峰。

以吸光度為縱坐標(biāo)，不同濃度（mg/mL）的菝葜皂苷元為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

圖2 蘆筍總皂苷檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for total saponins

經(jīng)回歸分析，得回歸方程為y=1.152x+0.011 9，R2=0.994 6，式中y為吸光度，x為菝葜皂苷元的濃度。表明菝葜皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.2 mg/mL～1 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可作為蘆筍總皂苷含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2 各單因素對總皂苷含量的影響

3.2.1 不同提取溫度

不同提取溫度對蘆筍總皂苷的提取率的影響如圖3所示。

圖3 提取溫度對提取率的影響Fig.3 The effect of the temperature on the yield

由圖3可知，隨著提取溫度的增加，蘆筍總皂苷的提取率變化雖不明顯，但還是可以看出在60℃～80℃時，蘆筍總皂苷的提取率呈現(xiàn)上升趨勢；并在80℃到達(dá)最高，之后再80℃～100℃呈現(xiàn)下降趨勢。因此，提取溫度暫定為80℃。由于在70、80、90℃時，蘆筍總皂苷提取率較高且平穩(wěn)，因此正交試驗(yàn)的3個水平分別設(shè)計(jì)為 70、80、90℃。

3.2.2 不同提取時間

不同提取時間對蘆筍總皂苷的提取率的影響如圖4所示。

由圖4可知，隨著提取時間的增加，蘆筍總皂苷的提取率不斷增大，當(dāng)提取時間達(dá)到2 h以后，提取率開始呈現(xiàn)下降的趨勢。由于在1、1.5、2 h時，蘆筍總皂苷提取率較高且平穩(wěn)，因此正交試驗(yàn)的3個水平分別設(shè)計(jì)為 1、1.5、2 h。

圖4 提取時間對提取率的影響Fig.4 The effect of the extraction time on the yield

3.2.3 不同乙醇濃度

不同乙醇濃度對蘆筍總粗皂苷的提取率的影響如圖5所示。

圖5 乙醇濃度對提取率的影響Fig.5 The effect of the ethanol concentration on the yield

由圖5可知，當(dāng)乙醇濃度為50%～60%時，蘆筍總皂苷提取率隨著乙醇濃度的增大而緩慢增大，而當(dāng)乙醇濃度高于70%時，提取率明顯呈上升趨勢，乙醇濃度為90%時，蘆筍總皂苷的提取率上升到9.3%。由此可以說明，70%、80%、90%時，蘆筍總皂苷提取率呈上升趨勢，并趨于穩(wěn)定，因此正交試驗(yàn)的3個水平分別設(shè)計(jì)為70%、80%、90%。

3.2.4 不同料液比

不同料液比對蘆筍總粗皂苷的提取率的影響如圖6所示。

圖6 不同料液比對提取率的影響Fig.6 The effect of the ratio of materialto liquid on the yield

由圖6可知，當(dāng)料液比為 1∶20（g/mL）～1∶35（g/mL）時，蘆筍總皂苷提取率隨著料液比的增大而逐漸增加，而當(dāng)料液比大于1∶35（g/mL）時，提取率開始呈下降的趨勢，當(dāng)料液比增加到1∶40（g/mL）時，蘆筍總皂苷的提取率逐步下降到7.65%。由此可以說明，料液比為1∶35（g/mL）時，最有利于蘆筍總皂苷的提取。因此正交試驗(yàn)的 3 個水平分別設(shè)計(jì)為 1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）。

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

由極差分析可知，各因素對蘆筍總皂苷提取率的影響順序?yàn)椋阂掖紳舛?料液比>提取溫度>提取時間，因?yàn)?A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C1＞C3＞C2，D2＞D1＞D3，所以最優(yōu)組合為A3B3C1D2，即：乙醇濃度為90%，提取溫度為80℃，料液比為 1 ∶40（g/mL），提取時間為 1 h。經(jīng)驗(yàn)證，在該條件下蘆筍總皂苷提取率為10.68%，與正交試驗(yàn)的結(jié)果相近。

3.4 純化工藝的確定

3.4.1 萃取純化蘆筍總皂苷

采用石油醚和水飽和正丁醇萃取后，根據(jù)3.1中回歸方程公式計(jì)算所得，蘆筍總皂苷的含量達(dá)到44.8%，極大地提高了蘆筍總皂苷的純度。

3.4.2 大孔樹脂各級分總皂苷含量、固形物含量

采用大孔吸附樹脂進(jìn)行純化蘆筍總皂苷，分別收集不同流分的固形物，并對其中所含的蘆筍總皂苷進(jìn)行檢測與對比。

由表3可知，在用4 BV的蒸餾水洗脫時，已經(jīng)能將萃取物中的水溶性雜質(zhì)除盡，再繼續(xù)用蒸餾水洗脫，則沒有物質(zhì)被洗脫下來；20%乙醇洗脫用量至3BV時，在流份中總皂苷含量明顯呈減少狀態(tài)，當(dāng)用量達(dá)到4 BV時，開始有皂苷增加，說明皂苷隨著20%乙醇用量的增加，已有部分被解吸，因此，20%乙醇的用量確定為3 BV；當(dāng)50%乙醇洗脫時，第1 BV檢測出大量蘆筍總皂苷，并依此呈減弱，當(dāng)50%乙醇的用量為4 BV時，已經(jīng)能夠洗下大部分皂苷；當(dāng)80%乙醇洗脫時，4個流分均有少量皂苷析出，可以認(rèn)為蘆筍總皂苷已被完全洗下；95%乙醇洗脫流份中幾乎不含皂苷。根據(jù)3.1中回歸方程計(jì)算所得，各部分蘆筍總皂苷的含量分別為16.0%、11.1%、44.3%、32.5%、0% ，當(dāng)乙醇濃度為50%的第3個流分時，總皂苷含量最高為51.0%。

表3 不同洗脫劑用量對蘆筍總皂苷洗脫的影響Table 3 Effects of different dosage of eluting agent on elution of saponins from asparagus

3.5 蘆筍總皂苷純化前后抗氧化活性的測定

蘆筍總皂苷對DPPH自由基清除能力試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 總皂苷對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Scavenging effect of saponins on DPPH radicals

圖7 試驗(yàn)結(jié)果表明，在0～1 000 μg/mL范圍內(nèi)，各樣品清除DPPH自由基的效果隨濃度的增加而增加。在相同濃度下，隨著蘆筍總皂苷含量的提高，其清除DPPH自由基能力提高。計(jì)算后所得純化前、純化后和抗壞血酸的 IC50分別為 147.43、140.05、12.16 μg/mL。

蘆筍總皂苷對ABTS+自由基清除能力見圖8。

圖8 總皂苷對ABTS+自由基清除率的影響Fig.8 Scavenging effect of saponins on ABTS radicals

圖8 試驗(yàn)結(jié)果與DPPH自由基清除能力具有相同的趨勢，純化前后的蘆筍總皂苷均具有較強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力。計(jì)算所得純化前、純化后和抗壞血酸的 IC50分別為 212.76、169.70、10.61 μg/mL。蘆筍總皂苷的抗氧化活性為其在開發(fā)抗氧化、抗衰老產(chǎn)品領(lǐng)域提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對蘆筍總皂苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果表明乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度對總皂苷提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。本試驗(yàn)確定了回流提取法提取蘆筍總皂苷的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度為90%，料液比為 1∶40（g/mL），提取溫度為 80℃，提取時間為1 h，蘆筍總皂苷提取率為10.68%。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)原料均勻度和粉碎度對總皂苷提取率有很大影響，原料粉末越細(xì)越均勻，提取率越高；但原料粉末過細(xì)會造成溶液過濾困難。提取溫度過高、溶劑加入量過大、提取時間過長都會導(dǎo)致提取率降低，分析其原因可能與雜質(zhì)的溶出、溶劑的揮發(fā)、某些物質(zhì)的水解有關(guān)，有待于進(jìn)一步的研究。

通過石油醚脫脂處理，水飽和正丁醇萃取、HPD-100大孔樹脂吸附對蘆筍總皂苷進(jìn)行純化。采用水飽和正丁醇萃取后，蘆筍總皂苷的含量達(dá)到44.8%，極大地提高了蘆筍總皂苷的純度。確定了HPD-100大孔吸附樹脂純化蘆筍總皂苷的最佳純化工藝：上樣量濃度為5 mg/mL，洗脫流速為2 mL/min，分別使用0%、20%、50%、80%、95%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，各部分蘆筍總皂苷的含量分別為16.0%、11.1%、44.3%、32.5%、0%，當(dāng)乙醇濃度為50%的第3個流分時，總皂苷含量最高為51.0%，為純化前的4.78倍。對比研究純化前后蘆筍總皂苷對自由基的清除能力。研究發(fā)現(xiàn)，隨著蘆筍皂苷含量的提高，體外抗氧化活性增大。清除DPPH自由基效果較好，其IC50分別為147.43、140.05 μg/mL；對 ABTS+自由基的 IC50分別為212.76、169.70 μg/mL。