超聲酶解提取高良姜中高良姜素及降尿酸活性研究

費(fèi)強(qiáng)，薛穩(wěn)來，趙耀鑫，趙玲

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

高良姜（Alpinia officinarum Hance）為姜科山姜屬植物，別名小良姜、海良姜，也是美國“公認(rèn)安全使用物質(zhì)”之一[1]。高良姜作為傳統(tǒng)的中藥材，主要分布在我國華南地區(qū)熱帶、亞熱帶氣候區(qū)域，野生資源主要分布在海南、廣東、廣西和云南等省區(qū)，福建、江西、臺(tái)灣亦有少量分布[2－3]。其主要化學(xué)成分有黃酮類、揮發(fā)油和二苯基庚烷等[4－5]，現(xiàn)代藥理研究表明，高良姜具有抗氧化、抗腫瘤，抗炎鎮(zhèn)痛等作用[6－7]。

近期數(shù)據(jù)報(bào)道，高良姜提取物具有降尿酸效果[8－9]，高尿酸血癥是指正常嘌呤飲食狀態(tài)下，非同日2次空腹血尿酸水平：男性＞420 umol/L，女性＞360 umol/L[10]，痛風(fēng)與血尿酸濃度發(fā)生密切，且高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)作的重要因素[11－12]。目前對(duì)于高良姜的提取多采用傳統(tǒng)的醇提法，該法提取效率低且消耗大量溶劑，高良姜中高良姜素的富集，可見的文獻(xiàn)有醇提水沉、大孔樹脂、重結(jié)晶等方法，操作較為繁瑣[13－14]。

本文采用超聲結(jié)合酶解的方法，提高高良姜中高良姜素的提取率，提取液減壓濃縮后萃取得到5個(gè)極性部位，回收溶劑至干，得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位，采用體外對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制及體內(nèi)小鼠尿酸值評(píng)價(jià)降尿酸的有效部位[15－18]，以期為高良姜的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

高良姜（采自1.廣東湛江甲子鎮(zhèn)新昌村、2.廣西博白雙鳳鎮(zhèn)良榮村、3.廣東徐聞龍?zhí)伶?zhèn)華林村、4.廣東徐聞龍?zhí)伶?zhèn)龍?zhí)链濉?.廣東徐聞縣龍?zhí)伶?zhèn)下池村、6.廣東徐聞縣龍?zhí)伶?zhèn)水頭村、7.廣東亳州譙東鎮(zhèn)辛集村、8.廣東徐聞龍?zhí)伶?zhèn)山田村、9.廣東徐聞龍?zhí)伶?zhèn)安留村、10.廣西廉江清平鎮(zhèn)橫坑村，經(jīng)藥谷科技開發(fā)有限公司鑒定均為姜科植物高良姜）；纖維素酶（50 U/mg）、黃嘌呤氧化酶（50 U/mg）：源葉生物有限公司；尿酸測定試劑盒：京森貝咖生物有限公司；高良姜素（純度100%）、尿酸（純度100%）：中國食品藥品檢定研究院；別嘌醇、氧嗪酸鉀、石油醚（60℃～90℃）、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），其他試劑均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；昆明小鼠110只，雄性，體重 20 g～23 g。

島津高效液相LC－20AT：日本島津；40KHZ超聲波清洗機(jī)：潔拓電子有限公司；pHS－3CpH計(jì)：上海佑科；AL204分析天平：梅特勒－儀器有限公司；RE－501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：長城科工貿(mào)有限公司；LDP－1000A中藥粉粹機(jī)：旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；DZF－6050型真空干燥箱：博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

高良姜素色譜條件：色譜柱：cosmosil C18（250 mm×4.6 mm，5 um，K63571）；流動(dòng)相：甲醇（A）－0.2%磷酸（B）=54∶46；檢測波長：266 nm；柱溫：40℃；流速：1.0 mL/min[19]。尿酸色譜條件：色譜柱：phenomenon C18（250 mm×4.6 mm，5 um，10372605）；流動(dòng)相：甲醇（A）－50 mmol/L醋酸銨（B）=1∶99；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

稱取高良姜素13.16、14.78 mg分別置于100 mL容量瓶，甲醇稀釋至刻度，精密移取5 mL置于25 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配制成高良姜素質(zhì)量濃度為26.32、29.56 μg/mL的對(duì)照品溶液。稱取尿酸35.89、37.86 mg分別置于100 mL容量瓶，甲醇稀釋至刻度，精密移取5 mL置于25 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配制成尿酸質(zhì)量濃度為71.78、75.72 μg/mL的對(duì)照品溶液，其對(duì)照品高效液相色譜（high performance liquid romatography，HPLC）分別見圖1、圖2。

1.3 最優(yōu)工藝條件的篩選

1.3.1 單因素試驗(yàn)

取一定量亳州碎過65目篩，提取條件為：固定料液比 1 ∶30（g/mL）、pH 5.0、酶解時(shí)間 45 min、考察不同纖維素酶用量（0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%）對(duì)高良姜素提取率的影響；固定料液比1∶30（g/mL）、pH 5.0、酶用量 0.9%、考察不同酶解時(shí)間（15、30、45、60、75 min）對(duì)高良姜素提取率的影響；固定料液比1 ∶30（g/mL）、酶解時(shí)間 45min、酶用量 0.9%、考察不同 pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0） 對(duì)高良姜素提取率的影響；固定pH 5.0、酶解時(shí)間45min、酶用量0.9%、考察不同料液比 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）對(duì)高良姜素提取率的影響，提取液4℃避光保存。

圖1 高良姜素對(duì)照品圖Fig.1 Chromatoragrams of galangin standard

圖2 尿酸對(duì)照品圖譜Fig.2 Chromatoragrams of uric acid standard

提取率=提取液的量（g）×高良姜素含量（mg/g）/藥材量（g）/藥材含量（mg/g）

1.3.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）的正交表進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，以高良姜素的提取率為指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 The design of levels and factors of orthogonal experiment

1.4 供試品溶液的制備

1.4.1 單因素試驗(yàn)

稱取亳州藥材粉末約1.0 g置于50 mL的錐形瓶中，按1.3.1項(xiàng)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，提取液靜置過濾，精密吸取5 mL置于25 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，測定高良姜素含量。

1.4.2 正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，稱取亳州藥材粉末約1.0 g置于50 mL的錐形瓶中，按1.3.2項(xiàng)進(jìn)行正交試驗(yàn)，提取液靜置過濾，精密吸取5 mL置于25 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，測定高良姜素的含量，優(yōu)選得到最佳的提取工藝。

1.4.3 不同產(chǎn)地高良姜素含量測定

10個(gè)不同產(chǎn)地高良姜藥材粉碎，過65目篩，稱取各產(chǎn)地的高良姜藥材粉末約4.0 g兩份，分別置于100 mL錐形瓶中，以最優(yōu)的超聲酶解條件提取，提取液靜置過濾，精密吸取5 mL置于50 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，得到供試品溶液。

1.5 降尿酸活性部位的篩選

1.5.1 不同活性部位的制備

稱取亳州藥材1 kg，按最優(yōu)工藝提取，得到提取液，16層紗布濾過，減壓濃縮至無醇味，石油醚萃取3次，每次1 000 mL，從分液漏斗上口倒出；二氯甲烷萃取3次，每次1 000 mL，從分液漏斗下口放出；乙酸乙酯萃取3次，每次1 000 mL，從分液漏斗上口倒出；正丁醇萃取3次，每次500 mL，從分液漏斗上口倒出，最后剩余水部位，將各部位的萃取液減壓濃縮，真空干燥得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位。

1.5.2 體外黃嘌呤氧化酶活性測定

按項(xiàng)1.5.1得到的5個(gè)不同極性部位，分別配置濃度為50、100、200 ug/mL的溶液，取各部位不同濃度測試品溶液200 μL，加入0.19 ug/mL的黃嘌呤氧化酶溶液200 mL，在35℃下孵化15 min，加入1.0 mmol/L黃嘌呤溶液400 μL，37℃反應(yīng)30 min，加入1 mol/L鹽酸200 μL終止反應(yīng)，磷酸緩沖鹽定容至2 mL，空白對(duì)照、陰性對(duì)照溶液用磷酸緩沖鹽溶液代替樣品液，HPLC法測定尿酸的生成。

1.5.3 體內(nèi)高良姜降尿酸活性篩選

取適量氧嗪酸鉀，以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）溶液混懸，配制成12.5 mg/mL的造模液。110只昆明種雄性小鼠，按體重隨機(jī)分為11組，每組10只，分別設(shè)為空白組、模型組、別嘌醇組及8組高良姜各不同部位提取物干燥品。11組動(dòng)物，置于代謝籠中，自由飲食飲水，空白組及模型組灌胃給予0.5%CMC－Na，其他各組每天灌胃給予相應(yīng)的藥物，給藥劑量均為0.2 mL/10 g，連續(xù)給藥7 d，第6天，除空白組腹腔注射0.2 mL/10 g 0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）溶液，其他各組腹腔注射氧嗪酸鉀溶液0.2 mL/10 g，1小時(shí)后，摘眼球取血，上述樣品分別按尿酸測定試劑盒操作，測定UA值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用origin8.5軟件作圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用spss11.5軟件統(tǒng)計(jì)分析，分析結(jié)果以±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液適量，甲醇分別配置成高良姜素 1.316、2.632、5.264、13.16、20.246、26.32 μg/mL 和尿 酸 3.768、7.572、15.144、37.86、58.246、75.720 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別以高良姜素和尿酸的濃度（X）為橫坐標(biāo)，面積（Y）為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，高良姜素對(duì)照品的回歸方程為Y=47 685.140 1X－1 368.531 9，R2=0.999 9；尿酸的回歸方程為Y=18 218.657 2X－387.891 6，R2=0.999 9，結(jié)果顯示高良姜素和尿酸濃度分別在 1.316μg/mL～26.32μg/mL、3.786μg/mL～58.246μg/mL與峰面積線性關(guān)系較好。

2.1.2 精密度試驗(yàn)

取配置好的高良姜素26.32μg/mL、尿酸75.72μg/mL，按項(xiàng)1.2.1項(xiàng)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，高良姜素和尿酸的RSD分別為0.69%、0.72%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取亳州藥材粉末，按項(xiàng)1.4.2制備6份供試品，分別測定高良姜素和尿酸的峰積，兩者RSD分別為1.27%、1.32%，結(jié)果表明該色譜條件方法良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在室溫下，取亳州藥材粉末，按項(xiàng)1.4.2制備供試品，在 0、4、8、12、18、24 h 測定，記錄峰面積值，高良姜素和尿酸24 h內(nèi)的RSD分別為1.17%、0.96%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定亳州高良姜藥材粉末2.0 g，按項(xiàng)1.4.2制備供試品溶液，分別精密加入一定量高良姜素和尿酸對(duì)照品溶液，測定高良姜素和尿酸的平均加樣回收率分別為99.26%、98.57%，結(jié)果表明，此方法準(zhǔn)確度高，滿足測定要求。

2.2 各單因素對(duì)高良姜中高良姜素提取效果的影響

2.2.1 不同酶用量對(duì)高良姜素提取率的影響

細(xì)胞壁的主要成分是纖維素和果膠，利用酶能夠破壞高良姜細(xì)胞壁，促進(jìn)高良姜素的溶出酶用量對(duì)高良姜素提取率的影響見圖3。

圖3 酶用量對(duì)高良姜素提取率的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on the extraction rate of galangin

由圖3可知，在酶用量0.3%～0.9%之間，高良姜素提取率隨酶用量的增加而逐漸提高并且在0.9%達(dá)到最高點(diǎn)，酶用量超過0.9%后，高良姜素的提取率逐漸降低，可能是由于酶解的同時(shí)過多的纖維素附著在高良姜的表面，導(dǎo)致高良姜素不能從細(xì)胞壁中溢出，因此選擇酶用量0.6%、0.9%、1.2%作為正交試驗(yàn)條件。

2.2.2 不同酶解時(shí)間對(duì)高良姜素提取率的影響

不同酶解時(shí)間對(duì)高良姜素提取率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的增加，高良姜的提取率逐漸增加，30分鐘前，曲線較陡表明酶解時(shí)間對(duì)高良姜素提取率影響大，30分鐘后，隨著酶解時(shí)間的增加，高良姜素的提取率趨于平穩(wěn)，說明酶解30 min時(shí)高良姜素提取較完全，因此選擇酶解時(shí)間15、30、45 min作為正交試驗(yàn)條件。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)高良姜素提取率的影響Fig.4 Effect of enzyme time on the extraction rate of galangin

2.2.3 不同pH值對(duì)高良姜素提取率的影響

pH值主要影響酶的活性，合適的pH值可提高酶解的效率見圖5。

圖5 pH值對(duì)高良姜素提取率的影響Fig.5 Effect of pH on the extraction rate of galangin extraction

由圖5可知，當(dāng)pH值等于5.0時(shí)高良姜素提取率達(dá)到最大，過高或過低的pH值均會(huì)影響纖維素酶的活性及構(gòu)象，阻礙底物與纖維素酶的結(jié)合，因此選擇pH值為4.5、5.0、5.5作為正交試驗(yàn)條件。

2.2.4 考察不同料液比對(duì)高良姜素提取率的影響

在一定的料液比內(nèi)，高良姜素提取率隨著料液比的增加先增大后減小，可能是由于增加料液比同時(shí)增加了溶劑、酶和底物三者之間的接觸表面積見圖6。

圖6 料液比對(duì)高良姜素提取率的影響Fig.6 Effect of material-liquid on the rate of galangin

由圖6可知，料液比達(dá)到1∶20（g/mL）時(shí)，提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增加溶劑量，提取率不會(huì)隨著增加。因此選擇料液比 1∶10、1∶20、1∶30（g/mL）作為正交試驗(yàn)條件。

2.2.5 正交試驗(yàn)

依據(jù)2.2各單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比（A）、pH（B）、酶用量（C）、酶解時(shí)間（D）4個(gè)因素按照L9（34）正交表對(duì)高良姜中高良姜素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，見表2，方差結(jié)果分析見表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and results

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The result of variance analysis

由正交試驗(yàn)結(jié)果可得：4種因素對(duì)高良姜中高良姜素提取率的影響順序依次為料液比（A）>酶解時(shí)間（D）>酶用量（C）>pH值（B），其中料液比和酶解時(shí)間對(duì)高良姜素提取率影響顯著。表2可得最佳超聲酶解提取工藝為 A2B2C2D1，即料液比為 1 ∶20（g/mL）、pH 值為5.0、酶用量0.9%、酶解時(shí)間30 min。根據(jù)確定的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，高良姜中高良姜素的提取率為8.85 mg/g。

2.3 HPLC測定10個(gè)產(chǎn)地高良姜素含量

按項(xiàng)1.4.3制備供試品溶液，項(xiàng)1.2.1色譜條件分別測定高良姜素的含量，結(jié)果見表4。

2.4 降尿酸活性部位篩選

2.4.1 體外黃嘌呤氧化酶活性測定

按項(xiàng)1.4.3對(duì)不同極性部位進(jìn)行黃嘌呤氧化酶抑制活性的測定，以測定的尿酸值計(jì)算各部位的抑制率，結(jié)果見表5。

表4 不同產(chǎn)地高良姜含量測定Table 4 Content determination results of Alpinia officinarum Hance from different areas

表5 不同極性部位對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率Table 5 Inhibition of xanthine oxidase by different polarity fractions

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高良姜乙酸乙酯部位和二氯甲烷部位對(duì)黃嘌呤氧化酶均具有較好的抑制率，其他極性部位不具有抑制作用，且高濃度組的抑制效果較低濃度的效果好，200 μg/mL的乙酸乙酯部位抑制率高達(dá)89.24%，與別嘌醇組（抑制率94.82%）相當(dāng)，說明乙酸乙酯部位活性最強(qiáng)，有效部位為乙酸乙酯部位。

2.4.2 體內(nèi)高良姜素降尿酸活性篩選

表6 體內(nèi)高良姜素降尿酸活性篩選Table 6 Active screening of galangin uric acid in the body

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與模型組相比，乙酸乙酯部位降尿酸效果顯著，二氯甲烷和正丁醇部位小鼠的尿酸值有小幅度的下降，但其降尿酸效果較乙酸乙酯弱，石油醚和水部位幾乎沒有降尿酸效果；與別嘌醇組比，乙酸乙酯高劑量組降尿酸效果與別嘌醇組相當(dāng)，且高劑量組優(yōu)于低劑量組，有效部位為乙酸乙酯部位。

3 結(jié)論

選取4個(gè)影響超聲酶解提取高良姜中高良姜素的工藝條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交設(shè)計(jì)軟件SPSS statistic 19.0優(yōu)化高良姜的提取工藝，得到最佳的工藝條件為料液比 1 ∶20（g/mL）、pH 5.0、酶用量0.9%、酶解時(shí)間30 min，其影響順序依次為料液比>酶解時(shí)間>酶用量>pH值，超聲結(jié)合酶解較傳統(tǒng)的醇提法轉(zhuǎn)移率高，節(jié)約溶劑。

HPLC法測定高良姜素和尿酸含量時(shí)，工作曲線線性良好，精密度高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，回收率高。并進(jìn)行10個(gè)不同產(chǎn)地高良姜中高良姜素含量測定，數(shù)據(jù)表明山田村蔬菜地高良姜素的含量均高于其他地區(qū)，這可能與該地的地理環(huán)境和氣候條件有關(guān)，為我國高良姜的種植提供借鑒。

高良姜不同極性部位降尿酸活性研究，結(jié)果表明：體外對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制和小鼠體內(nèi)降尿酸均顯示其有效部位為乙酸乙酯部位，且高劑量組對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率和降尿酸效果均優(yōu)于低劑量組，表明高良姜提取物萃取得乙酸乙酯部位具有較好的降尿酸效果。目前對(duì)于痛風(fēng)的治療多為西藥，絕大部分有副作用且治標(biāo)不治本，高良姜作為藥食兼用的植物資源，期望開發(fā)為治療痛風(fēng)的有效藥物，為痛風(fēng)的治療提供更多更好的選擇。