響應(yīng)面法優(yōu)化離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶

曾穎，朱新儒，余壘，李雄，張海德

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

番木瓜（Carica papaya L.）原產(chǎn)于墨西哥南部以及鄰近的美洲中部地區(qū)。在我國主要分布在廣東、海南、廣西、云南、福建、臺灣等省（區(qū)）。木瓜蛋白酶（papain）是存在于番木瓜的根、莖、葉和果實(shí)內(nèi)的一種低特異性蛋白水解酶，其中在未成熟的乳汁中含量最豐富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，屬于含巰基（-SH）肽鏈內(nèi)切酶，它具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點(diǎn)，因此在食品[1]、醫(yī)藥[2]、飼料[3]、日化[4]、皮革[5]及紡織[6]等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。木瓜蛋白酶是100%的天然物質(zhì)，因此在食品及飲料工業(yè)上有獨(dú)特的廣闊發(fā)展前途[7]。

離子液體，又稱低溫熔融鹽，是指在室溫或接近室溫下呈現(xiàn)液態(tài)的、完全由陰陽離子所組成的鹽。由于離子液體具有非常獨(dú)特的理化性能，非常適合于用作分離提純的溶劑。2003年，Gutowski等采用親水性離子液體1-丁基-3-甲基咪唑鹽酸鹽（[Bmim]Cl）和磷酸鉀（K3PO4）首次提出了離子液體雙水相體系這一概念。離子液體雙水相相較于傳統(tǒng)雙水相既為蛋白質(zhì)的萃取營造了溫和的環(huán)境，又避免了萃取過程中有機(jī)溶劑的使用，具備萃取率高、兩相界面清晰、黏度低、綠色環(huán)保、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。因此近年來在分離生物活性物質(zhì)方面迅速發(fā)展并在分離生物活性物質(zhì)[8-9]方面被廣泛研究。

本試驗(yàn)利用離子液體雙水相對木瓜中的木瓜蛋白酶進(jìn)行分離純化，旨在從方法上尋求新的突破，為木瓜蛋白酶的純化提供更多的理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶（BR，>2 000 U/mg）：生工生物（上海）股份有限公司；[C2mim]Ac、[C4mim]Ac、[C6mim]Ac、[C8mim]Ac：蘭州雨陸精細(xì)化工有限公司；K2HPO4（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1901紫外可見分光光度計：北京普析通用有限責(zé)任公司；DK-98-1型恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；HJ-5型多功能恒溫攪拌器：常州華奧儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)測定方法

用Bradford法[10]來測定蛋白質(zhì)的含量。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，1.0 mL樣液加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染色液5.0 mL，反應(yīng)5 min左右在595 nm波長下測定吸光度。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：A595=0.007x+0.000 5，R2=0.999 2。

1.3.2 雙節(jié)線的測定

在295.15 K的條件下采用濁點(diǎn)法制作雙節(jié)線[11]。分別配制一定濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%左右）的離子液體溶液于大試管中，逐滴加入一定濃度的鹽溶液，直到溶液剛好變渾濁，記下消耗的鹽溶液體積。再加入重蒸水使溶液澄清，重復(fù)上述操作。計算出在溶液渾濁時離子液體和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)繪制相圖。

1.3.3 分配系數(shù)測定

配制一定量的的離子液體、無機(jī)鹽和木瓜蛋白酶溶液，震蕩混勻后以5 000 r/min離心10 min，讀取上下

式中：cT和cB分別為雙水相體系中上下相的蛋白酶的濃度，mg/mL。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

離子液體側(cè)鏈烷基對分配系數(shù)的影響：以相圖為指導(dǎo)，用不同的離子液體配制相同質(zhì)量組成的雙水相，固定離子液體和K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為25%、18%，加入等量適量的酶液，測定木瓜蛋白酶的分配系數(shù)。

離子液體濃度對分配系數(shù)的影響：配制離子液體濃度為20%、24%、28%、32%、36%，K2HPO4濃度固定為18%的雙水相，加入等量適量的酶液，測定木瓜蛋白酶的分配系數(shù)。

K2HPO4濃度對分配系數(shù)的影響：保持[C8mim]Ac濃度為24%不變，根據(jù)相圖，選取K2HPO4濃度為16%、18%、20%、22%、24%的雙水相體系。加入等量適量的酶液，測定木瓜蛋白酶的分配系數(shù)。

pH值對分配系數(shù)的影響：雙水相pH值分別調(diào)節(jié)為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，K2HPO4濃度為 18%，[C8mim]Ac濃度為24%，加入等量適量的酶液，測定木瓜蛋白酶的分配系數(shù)。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對離子液體濃度（A）、鹽濃度（B）、pH值（C）這3個因素進(jìn)行優(yōu)化，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計，以分配系數(shù)（K）作為考察指標(biāo)，獲得木瓜蛋白酶的最佳條件萃取條件。試驗(yàn)因素水平見表1。相的體積，測定上下相的蛋白濃度，分配系數(shù)（K）的計算公式如下：

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM（response surface methodology）

2 結(jié)果與分析

2.1 雙節(jié)線的測定及關(guān)聯(lián)

本試驗(yàn)研究了[Cnmim]Ac（n=2，4，6，8）和 K2HPO4的相形成能力，[Cnmim]Ac（n=4，6，8）與 K2HPO4的相圖見圖1。

圖1 [Cnmim]Ac（n=4，6，8）與 K2HPO4的相圖Fig.1 Phase diagram of the[Cnmim]Ac（n=4，6，8）with K2HPO4

雙節(jié)線越靠近原點(diǎn)，則成相能力越好，從圖1可以看出咪唑類醋酸鹽的成相能力為：[C8mim]Ac>[C4mim]Ac>[C6mim]Ac。一般情況下離子液體陽離子側(cè)鏈烷基越長，則離子液體疏水性越強(qiáng)，更容易形成雙水相。而[C2mim]Ac難以與K2HPO4形成雙水相。

用Merchuk[12]方程對雙節(jié)線數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。

式中：WIL、WS分別表示離子液體和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；a、b、c為方程參數(shù)。雙節(jié)線數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)結(jié)果見表2。

表2 雙節(jié)線數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)結(jié)果Table 2 Binodal correlation results

由表2，可以看出對雙節(jié)線數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)效果非常好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 離子液體側(cè)鏈烷基對分配系數(shù)的影響

以相圖為指導(dǎo)，用3種離子液體配制相同質(zhì)量組成的雙水相，固定離子液體和K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為25%、18%，加入等量適量的酶液，結(jié)果如圖2所示。

木瓜蛋白酶的分配系數(shù)隨著離子液體陽離子側(cè)鏈烷基的增加而增大。咪唑類醋酸鹽離子液體的疏水性隨側(cè)烷基鏈增長緩慢加強(qiáng)，因此長鏈烷基可能更有利于木瓜蛋白酶被萃取到上相中。因此，選取萃取效果最好的[C8mim]Ac來進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.2 離子液體濃度對分配系數(shù)的影響

離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化對木瓜蛋白酶分配行為的影響見圖3。

圖2 離子液體烷基側(cè)鏈變化對木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig.2 Effects of the alkyl chain length of ionic liquids on the partition behavior

圖3 離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化對木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig.3 Effects of the mass of ionic liquids on the partition behavior

固定K2HPO4濃度為18%，配制[C8mim]Ac濃度為20%、24%、28%、32%、36%的雙水相，由圖3可知K值先上升后下降，在[C8mim]Ac濃度為28%時取得最大值11.44。隨著[C8mim]Ac濃度增加（>28%），富含離子液體的上相體積也會增加，雖然可能對酶的萃取量變大了，但是上相酶濃度也會隨上相體積的變大而降低，所以總體的K值開始下降。

2.2.3 K2HPO4濃度對分配系數(shù)的影響

K2HPO4濃度變化對木瓜蛋白酶分配行為的影響見圖4。

圖4 K2HPO4濃度變化對木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig.4 Effects of the mass of K2HPO4on the partition behavior

于是保持[C8mim]Ac濃度為28%不變，選取K2HPO4濃度為16%、18%、20%、22%、24%。圖4得出，K值先增大后減小，這可能是因?yàn)镵2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加導(dǎo)致了鹽析作用增強(qiáng)，木瓜蛋白酶轉(zhuǎn)移到上相。但是同時上相的水分子慢慢減少，與蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基形成氫鍵能力減弱，當(dāng)[C8mim]Ac濃度過大時上相的黏度增加，也會阻礙木瓜蛋白酶的轉(zhuǎn)移能力。

2.2.4 pH值對分配系數(shù)的影響

pH值變化對木瓜蛋白酶分配行為的影響見圖5。

圖5 pH值變化對木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig.5 Effects of pH on the partition behavior

根據(jù)圖5得知：隨pH值的增大，K呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢，并在pH=9時取得最大值。pH值對離子液體雙水相中酶分配系數(shù)的影響是通過酶與成相物質(zhì)之間的氫鍵效應(yīng)和電荷效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。蛋白質(zhì)作為兩性分子，其帶電性質(zhì)受介質(zhì)值的影響[13]。當(dāng)pH值大于等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，與的離子液體的咪唑陽離子之間發(fā)生靜電作用。咪唑類離子液雙水相體系中，蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基與離子液體陽離子之間的疏水相互作用是萃取分離蛋白質(zhì)的主要動力[14]。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及方差分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對離子液體濃度（A）、鹽濃度（B）、pH 值（C）這 3個因素進(jìn)行優(yōu)化，以分配系數(shù)（K）作為考察指標(biāo)。根據(jù)響應(yīng)而分析試驗(yàn)設(shè)計原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of RSM

續(xù)表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果Continue table 3 Experimental design and results of RSM

2.3.2 回歸模型建立及顯著性分析

利用軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到分配系數(shù)K的二次多項(xiàng)式回歸模型如下：

對回歸模型進(jìn)行方差分析和回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表4和表5所示。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis for the regression model

表5 回歸模型的顯著性檢驗(yàn)Table 5 Significance test for the regression model

模型的失擬項(xiàng)均不顯著（P=0.479 9>0.05），說明方程對試驗(yàn)擬合度很好。回歸方程與實(shí)測值之間的擬合度可以通過相關(guān)系數(shù)（R2）和校正決定系數(shù)（Adj.R2）來解釋。方程3的相關(guān)系數(shù)為99.7%，說明模型實(shí)測值和預(yù)測值之的擬合度都非常好。校正決定系數(shù)為99.31%，說明該回歸模型可以解釋99.31%的數(shù)據(jù)的變異性，因此可利用該模型對分配系數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測。

從回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)的絕對值大小可評價該因素對試驗(yàn)指標(biāo)影響程度[15]。方程2顯示，各因素對分配系數(shù)K的影響順序?yàn)閜H值>[C8mim]Ac的質(zhì)量分?jǐn)?shù)>K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在該水平范圍內(nèi)，AB、BC、AC、A2、B2、C2對K的影響極顯著，A、B對K的影響顯著。

2.3.3 響應(yīng)曲面分析

在回歸分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)回歸方程擬合繪制響應(yīng)面圖，如圖6所示。

圖6 分配系數(shù)K的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Responsive surface and contour plot of partition coefficient K

兩因素間交互作用的強(qiáng)弱可以通過等高線圖來判斷，若等高線為圓形，則表示兩者交互作用不顯著，等高線圖呈橢圓形，說明交互作用顯著[16-17]。AC的交互作用較AB、BC而言對K的影響最為顯著。

2.3.4 最優(yōu)萃取條件的確定及模型驗(yàn)證

通過Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，得出 [C8mim]Ac-K2HPO4系統(tǒng)萃取木瓜蛋白酶的最佳萃取條件為：離子液體[C8mim]Ac濃度為28.03%，K2HPO4濃度為20.08%，pH值為8.55，此時分配系數(shù)K的預(yù)測值為11.65。按照優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)以考察模型的可靠性，得分配系數(shù)的平均值為11.85，與預(yù)測值11.65非常接近，相差僅為1.69%。

3 結(jié)論

在同樣的條件下，分別測定 [Cnmim]Ac（n=2、4、6、8）離子液體和K2HPO4的成相能力，[C8mim]Ac的成相效果比[C4mim]Ac、[C6mim]Ac都要好。利用Merchuk方程對雙節(jié)線數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，相關(guān)系數(shù)都大于0.99，說明關(guān)聯(lián)效果非常好，這為進(jìn)一步試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。通過對各單因素的考察可知，[C8mim]Ac的萃取效果優(yōu)于[C6mim]Ac和[C4mim]Ac，然后釆用響應(yīng)面法優(yōu)化離子液體濃度、鹽濃度、pH值這3個因素，最佳條件下分配系數(shù)可以達(dá)到11.65。與預(yù)測值11.85非常接近，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的提取條件可靠。