斑蝥酸鈉對膀胱癌患者樹突狀細胞及BIU-87細胞的影響

寧 波，李朵璐，闞全程

(鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 450000)

膀胱瘤是最常見的惡性腫瘤之一，它具有發病率高、復發率高、惡性程度低等特點[1]。膀胱癌患者的主要癥狀為血尿，臨床上常采用造影和膀胱鏡檢作為膀胱腫瘤的診斷方法。膀胱癌可分為表淺性和浸潤性兩類，表淺性膀胱癌具有復發率高，轉移率低的特點。浸潤性膀胱癌具有浸潤性和轉移率高等特點[2]。樹突狀細胞(DC)是一種抗原遞呈細胞，具有攝取、加工及遞呈抗原，刺激T細胞活化和增殖，啟動機體特異性免疫應答等功能，因此在腫瘤免疫過程中發揮關鍵作用[3]。有研究發現，如果DC數量減少或者功能缺失，使得DC不能刺激淋巴細胞增殖及免疫應答，最終導致機體免疫耐受，從而使腫瘤細胞逃脫機體免疫系統，在腫瘤的發生、發展和轉移過程中起重要作用[4]。研究證實DC與膀胱癌有十分緊密的關系，與膀胱癌的分級和患者預后有緊密聯系[4-5]。

DC在發育過程中能表達一系列分化抗原，其中最直接與其功能有關的是CD1a，CD1a主要表達于人胸腺細胞，是鑒定人外周血與骨髓中DC的最好標記[6]。CD83是DC成熟的標志，在DC發育成熟的早期不表達CD83，當成熟時才表達CD83。由于腫瘤細胞CD83的低水平表達，不能使腫瘤抗原引起有效的免疫應答，從而誘導了T細胞的無能狀態，使得機體的免疫系統不能將腫瘤細胞清除，是腫瘤無限制性生長的主要原因之一[7]。膀胱癌細胞BIU-87來源于人膀胱乳頭狀移行上皮癌，通常采用5×108細胞0.2 mL接種裸鼠皮下，腫瘤呈進行性生長，腫瘤結節病理檢查與原標本癌組織相似，是臨床實驗室常用的實驗用途膀胱癌細胞系。

斑蝥酸鈉是斑蝥素的一種衍生物，目前臨床上用于治療肝癌和胃癌，與先導化合物斑蝥素比較，斑蝥酸鈉具有毒性低和刺激性小等特點[8-11]。斑蝥酸鈉抗腫瘤機制復雜多樣，它能通過多種途徑抑制腫瘤細胞，其中包括阻斷細胞周期、誘導細胞產生凋亡、抑制腫瘤細胞侵襲和轉移、提高患者機體免疫力等[12-14]。

在本實驗中，一方面研究斑蝥酸鈉對膀胱癌患者外周血來源的DC的成熟及功能的影響，另一方面研究斑蝥酸鈉對膀胱癌細胞BIU-87增殖和凋亡的影響，進而從改變患者機體免疫力和抑制膀胱腫瘤細胞來綜合探討斑蝥酸鈉的作用，為斑蝥酸鈉臨床應用于膀胱癌患者提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1材料 重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rh-GM-CSF)和重組人白細胞介素-4(rh-IL-4)(R&D Systems，USA)；FITC標記的抗人CD1a和CD83(USA)；Caspase-3、PARP、GAPDH一抗、HRP標記二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)；Ficoll paque plus淋巴細胞分離液(GE Amersham Biosciences，USA)；RPMI-1640培養基、胎牛血清(HyClone Laboratories，USA)；BCA蛋白濃度測定試劑盒和AimexinV-FITC凋亡檢測試盒(碧云天生物技術研究所)。

1.2DC體外培養及給藥方法 選取15例膀胱癌患者及10例健康成人，每人抽取靜脈血20 mL，采用Ficoll Paque Plus淋巴細胞分離液分離外周血單核細胞，在37 ℃，5% CO2的條件下培養2 h后，洗滌除去懸浮細胞，得到貼壁細胞。然后用含GM-CSF(1 000 IU/mL)、IL-4(500 IU / mL)和10%自體血清的RPMI-1640培養基培養，每24 h半量換液。在第5天將培養的細胞進行分組試驗，分成以下組別：對照組(Control)、斑蝥酸鈉低劑量組(0.01 μg/mL)、斑蝥酸鈉中劑量組(0.05 μg/mL)、斑蝥酸鈉高劑量組(0.25 μg/mL)、健康人組，第8天收集細胞行相關檢測。

1.3流式細胞儀檢測DC表面CD1a和CD83的變化 分別收集第8天的細胞，然后加入CD1a和CD83熒光抗體，室溫、暗室避光孵育30 min，然后再加入2 mL預冷磷酸緩沖液，最后用流式細胞儀檢測各組DC表面CD1a和CD83的表達情況。

1.4MTT法檢測斑蝥酸鈉對DC刺激淋巴細胞增殖的影響 取健康體檢人靜脈血，分離出單核細胞，在37℃，5% CO2的條件下培養細胞，2 h后吸取未貼壁的細胞，得到的即為淋巴細胞。收集培養第8天的各組DC并用絲裂霉素C(50 g/mL)孵育30 min，調整細胞密度為1×107/L，按照DC與淋巴細胞比例為1∶10混合，將混合細胞集中于96孔板，每組設6個復孔，連續培養48 h后，采用MTT法檢測細胞活力，在570 nm處檢測各孔吸光度值，按照公式計算淋巴細胞刺激指數。刺激指數=試驗組OD值/對照組OD值。

1.5MTT法檢測斑蝥酸鈉對膀胱癌BIU-87細胞的抑制作用 BIU-87細胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養，培養條件為37 ℃、5%CO2。實驗分為對照組(不加藥物)、10 μg/mL斑蝥酸鈉組、20 μg/mL斑蝥酸鈉組，每組設6個復孔，分別培養12、24、36和48 h后，加入MTT工作液，繼續孵育4 h后，加入100 μL DMSO，酶標儀檢測570 nm的吸光度值，計算細胞存活率。

1.6Annexin V-FITC/PI雙染法檢測斑蝥酸鈉對膀胱癌BIU-87細胞凋亡的影響 按照1.5的分組方法，取對數生長期的BIU-87細胞分別接種于6孔板中，給藥作用24 h后，消化、離心收集細胞，然后加入0.3 mL的結合緩沖液，混勻，每個測試樣品加入5 μL Annexin V和5 μL PI，在室溫孵育15 min后，補加0.2 mL結合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7Western blot法檢測Caspase-3和PARP的表達的變化 按照1.5方法處理細胞后，細胞用胰酶消化，收集細胞，用細胞裂解液破碎細胞，低溫離心5 min，收集上清液即為提取蛋白。用BCA法進行蛋白濃度測定，采用SDS-PAGE法進行電泳，濕法轉膜，脫脂奶粉封閉，分別加入Caspase-3、PARP和GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜，滴加HRP標記的二抗，室溫孵育2 h后，暗室滴加ECL發光液，掃描紀錄。

A：對照組；B：低劑量組；C：中劑量組；D：高劑量組；E：健康人組

圖1 DC形態(×400)

2 結 果

2.1流式細胞儀檢測DC、CD1a和CD83的變化 倒置顯微鏡拍照結果見圖1，與對照組相比，斑蝥酸鈉處理組細胞體積變大，細胞變長，斑蝥酸鈉高劑量組(圖1D)細胞出現突起，形如樹枝，和健康人組(圖1E)的細胞形態類似。流式細胞儀檢測結果如圖2所示，與對照組相比，CD83與CD1a在斑蝥酸鈉處理組中顯著升高(P<0.05)。另外CD83與CD1a在斑蝥酸鈉高劑量組中表達最高，且與健康人組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

*：P<0.05，**：P<0.01，與對照組比較；#：P<0.05，##：P<0.01，與健康人組比較

圖2 CD1a和CD83在DC中的表達

2.2斑蝥酸鈉刺激異體淋巴細胞增殖能力的檢測 與對照組相比，斑蝥酸鈉處理組刺激淋巴細胞增殖指數顯著高于對照組(P<0.05)。另外在斑蝥酸鈉各劑量組中，高劑量組刺激淋巴細胞增殖指數最高，且與健康人組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

*：P<0.05，**：P<0.01，與對照組比較；#：P<0.05，##：P<0.01，與健康人組比較

圖3斑蝥酸鈉刺激異體淋巴細胞增殖指數

2.3MTT法檢測斑蝥酸鈉對膀胱癌BIU-87細胞的抑制作用 與對照組相比，各給藥組中細胞存活率均有不同程度的降低，藥物的抑制作用隨斑蝥酸鈉濃度和時間的增加而增大，同一時間點不同處理組之間相比，細胞存活率差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4。

**：P<0.01，與對照組比較

圖4 MTT法檢測不同濃度斑蝥酸鈉處理后細胞的存活率

2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測斑蝥酸鈉對膀胱癌BIU-87細胞凋亡的影響 斑蝥酸鈉組與對照組相比，細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖5。

**：P<0.01，與對照組比較

圖5流式細胞術檢測不同處理組細胞凋亡狀況

2.5Western blot法檢測caspase-3和PARP蛋白表達的變化 與對照組相比，斑蝥酸鈉組BIU-87細胞中Caspase-3和PARP蛋白表達顯著增強(P<0.01)，見圖6。

**：P<0.01，與對照組比較

圖6 Western blot法檢測Caspase-3和PARP蛋白的表達

3 討 論

膀胱癌是最常見惡性腫瘤之一，臨床上主要采用保留膀胱的手術治療。這種治療方法會使腫瘤切除不徹底，導致一半左右的患者2年內腫瘤的復發率非常高。目前，為了解決這一弊端，臨床上在患者進行手術后，進行膀胱內灌注藥物治療，但是膀胱癌腫瘤常常發生耐藥現象。斑蝥酸鈉作為從天然化合物優化而來的化合物，不僅具有抗腫瘤活性，而且還能夠調節機體的免疫功能。斑蝥酸鈉具有相對分子質量小，容易進入細胞內的特點，另外還能提高患者免疫力。目前，臨床上采用斑蝥酸鈉與其他抗腫瘤藥物聯合，主要應用于肺癌、胃癌和老年膀胱癌等腫瘤的治療[15-17]。斑蝥酸鈉能夠提高機體免疫功能，通過增加白細胞的數量，使得細胞因子分泌增多，提高免疫反應的速度和強度[18-19]。

DC能夠攝取抗原，然后將抗原進行處理成具有免疫原性的多肽，在細胞表面表達MHC-抗原肽復合物，另外DC膜表面的特異分子能與淋巴細胞表面相應的配體結合，使抗原特異性T細胞得到激活和增殖，最終激活機體產生免疫應答[20-22]。DC廣泛分布于體內各個部分，但是整體細胞數量少，不能滿足實驗研究和臨床應用的要求，所以已經開發出多種途徑產生大量DC，來源主要包括骨髓、臍血、外周血，其中最常用的途徑為采集機體外周血，誘導成為DC[23]。

本實驗從患者外周靜脈血中梯度離心得到分離PBMC細胞，然后進行純化，剩余的貼壁細胞即為單核細胞，利用GM-CSF和IL-4誘導單核細胞轉化成DC。采用顯微鏡觀察細胞形態變化，然后用流式細胞儀檢測了DC表面的CD1a和CD80的表達情況。CD1a作為DC的特異性標志，CD1a表達量能夠顯示DC的數量，另外CD83分子是DC的成熟的標志[24-25]。

研究結果證明，斑蝥酸鈉與DC共孵育后，培養細胞表面產生突起，形如樹枝，同時DC表面CD1a和CD80的表達顯著升高，斑蝥酸鈉高劑量組與健康人組DC比較，差異無統計學意義。另外采用MTT方法檢測了斑蝥酸鈉對DC刺激淋巴細胞增殖能力，結果發現斑蝥酸鈉能夠增強淋巴細胞增殖能力。表明斑蝥酸鈉能夠增強膀胱癌患者DC的形成和CD1a與CD80分子的表達，進而提高患者的免疫能力。

細胞內環境的變化導致細胞應激反應的產生，進而會導致細胞發生自毀性死亡，即細胞凋亡。多種基因參與細胞的凋亡的整個過程，其中Caspase-3在此過程中發揮關鍵作用，當Caspase-3被激活后，細胞將會進入不可逆的凋亡進程，而且多種因素誘導的凋亡很大一部分都通過Caspase-3這一信號途徑實現。PARP是一種DNA修復酶，定位于細胞核內，當細胞通過Caspase-3導致凋亡產生時，活化的PARP Caspase-3能夠剪切激活PARP，進而導致細胞發生凋亡。

本實驗通過MTT法證明斑蝥酸鈉能夠顯著抑制膀胱癌BIU-87細胞的生長，且呈劑量和時間依賴性。通過Annexin V-FITC/PI雙染法證明斑蝥酸鈉能夠誘導膀胱癌BIU-87細胞發生凋亡。另外進一步研究了斑蝥酸鈉對凋亡蛋白Caspase-3和PARP表達的影響，結果發現，與對照組相比，斑蝥酸鈉組BIU-87細胞中Caspase-3和PARP蛋白表達升高，促進BIU-87細胞發生凋亡。

綜上所述，斑蝥酸鈉一方面能夠促進膀胱癌患者DC的成熟和增加DC刺激淋巴細胞的增殖能力，另一方面能夠抑制膀胱癌BIU-87細胞的增殖，并促進其發生凋亡。本研究為斑蝥酸鈉治療膀胱癌的臨床應用提供了一種新的策略，即膀胱灌注高劑量斑蝥酸鈉殺滅腫瘤細胞，然后體內給予低劑量斑蝥酸鈉激活機體免疫系統。