幽門螺桿菌誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究*

周法庭，朱紅玲，朱 華，王 毅，許 俊，楊振華△

(1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌 443003；2.宜昌市中心人民醫(yī)院急診科，湖北宜昌 443003；3.三峽大學(xué)消化疾病研究所，湖北宜昌 443003)

胃癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤排行中胃癌的發(fā)病率位居第5位，病死率位居第3[1]。近年來由于腌制食品攝入減少和胃鏡在臨床廣泛應(yīng)用，胃癌的病死率有所下降，但是我國仍然是胃癌高發(fā)國家[2]。2012年我國胃癌死亡總?cè)藬?shù)達(dá)29.8萬例，男性病死率僅次于肺癌和肝癌，女性病死率僅次于肺癌[3-4]。胃癌細(xì)胞早期發(fā)生轉(zhuǎn)移和浸潤是導(dǎo)致胃癌患者死亡和治療失敗的根本原因，大量研究證實上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchy transition,EMT)是調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要機制[5]。

EMT是機體常見的生物學(xué)變化，它參與了組織器官分化、傷口愈合、器官纖維化和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多種病理生理學(xué)過程[6]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT是指上皮來源的腫瘤細(xì)胞受多種因素刺激后，喪失上皮特征，獲得間充質(zhì)表型的過程。在這一過程中，腫瘤細(xì)胞的許多生物學(xué)特征發(fā)生改變，包括細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變成間充質(zhì)狀，骨架發(fā)生重塑、細(xì)胞連接破壞、極性消失、遷移和侵襲能力顯著增強[7]。在上述變化中，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)的降低被視為腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的標(biāo)志性改變。目前，研究發(fā)現(xiàn)趨化因子、細(xì)胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子和小分子RNA等均可調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，如轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、Snail和miR-203等[8]。而在上述化學(xué)因子中，有關(guān)TGF-β的研究最為透徹，常被作為陽性對照。當(dāng)TGF-β和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，形成TβRⅡ-TGFβ-TβRI復(fù)合物，可激活Smad 2/3-Smad4、Ras-MEK-ERK和TRAF-TAK1-JNK等多條信號軸來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的EMT過程。

在體內(nèi)，胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移除了受上述化學(xué)因子調(diào)控外，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)也是胃癌細(xì)胞最主要的生物刺激。Hp可生成尿素酶、空泡毒素、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白和黏附素等多種致病因子，持續(xù)刺激胃黏膜上皮細(xì)胞，引起胃炎、胃潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴瘤[9]。對于Hp誘發(fā)胃癌已成為毋庸置疑的事實，但是能否促使胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT卻鮮有報道[10]。本研究擬分析Hp刺激后胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT的情況，為胃癌轉(zhuǎn)移的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1材料 人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1和人胃癌細(xì)胞株SGC-7901均購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，兩種細(xì)胞株的鑒定和培養(yǎng)在本研究前期工作時順利完成。幽門螺桿菌 SS1(Sydney Strain 1,SS1)菌株購自Novagen公司。胰蛋白酶、RIMP 1640培養(yǎng)基和DAPI核酸性染料均購自Invitrogen公司；胎牛血清購自復(fù)蒙公司；蛋白提取試劑盒及ECL 發(fā)光試劑盒購自江蘇凱吉生物公司;BCA 試劑盒購自碧云天公司。E-cadherin (H-108) 、Snail 1(H-130)、MMP-9(6-6B)兔多克隆抗體和N-cadherin(H-4)、Vimentin (V-9)鼠單克隆抗體購自Santa Cruz公司，β-actin鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將GES-1和SGC-7901細(xì)胞分別接種在RIMP 1640完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清，100 mg/mL的鏈霉素、1×104U/L青霉素)常規(guī)培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)，待細(xì)胞融合度90%左右，用2.5%的胰蛋白酶處理至細(xì)胞形態(tài)變圓后終止消化，傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗研究。

1.2.2幽門螺桿菌培養(yǎng) 將幽門螺桿菌SS1菌株按1.0%的體積比接種至布氏肉湯液體培養(yǎng)基(含5%的胎牛血清)中，置于微需氧(37 ℃、5% CO2和85% N2)環(huán)境中培養(yǎng)，根據(jù)Hp菌落數(shù)量，繪制生長曲線。參考HAN等[11]的實驗方法，取對數(shù)期的SS1菌株進行實驗，離心收集并重懸后，分別加入GES-1細(xì)胞或SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)基中。

1.2.3Transwell小室檢測胃癌細(xì)胞縱向遷移 待SGC-7901細(xì)胞或GES-1細(xì)胞融合度達(dá)到90%時，以胰酶消化后，進行計數(shù)和稀釋，將懸液中細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為2×105個/mL。分別取200 μL的SGC-7901細(xì)胞或GES-1細(xì)胞懸液接種于Transwell 上室，設(shè)置空白對照組、陽性對照組(TGF-β)和實驗組(幽門螺桿菌SS1菌株)，Transwell小室放置于24 孔板的小孔中。然后取600 μL 不含血清的RIMP 1640 培養(yǎng)基加入Transwell下室，陽性對照組和實驗組分別加入TGF-β(終濃度5 ng/mL)和幽門螺桿菌SS1菌株(最終MOI為500)，空白對照組加入等體積的不含血清的RIMP 1640培養(yǎng)基，放回CO2孵箱中，培養(yǎng)2 h[12]。取出并棄去原有培養(yǎng)基，分別經(jīng)PBS 洗滌、多聚甲醛固定后，用0.1% 結(jié)晶紫染色20 min后。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，隨機選取5條直徑，沿每條直徑隨機取5 個視野拍照，統(tǒng)計穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白的表達(dá) 按照1.2.1傳代和培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞或GES-1細(xì)胞，兩種細(xì)胞均設(shè)置空白對照組、陽性對照組和實驗組，陽性對照組和實驗組分別加入TGF-β和幽門螺桿菌SS1菌株，終濃度分別為5 ng/mL和500 MOI。放入CO2孵箱中培養(yǎng)，2 h后以RIPA裂解液收集總蛋白，經(jīng)BCA法定量、變性、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，4 ℃過夜孵育相應(yīng)一抗(1∶200)。再經(jīng)TBST洗滌、孵育二抗(1∶5 000)、洗滌后，采用增強化學(xué)發(fā)光法( enhanced chemiluminescence，ECL) 在凝膠成像儀( ChemiDocTMXRS & Image LabTM，美國Bio-Rad 公司) 中檢測蛋白的表達(dá)變化。

1.2.5免疫熒光法檢測β-catenin的分布 按照1.2.3處理SGC-7901細(xì)胞或GES-1細(xì)胞，培養(yǎng)2 h后，經(jīng)PBS液洗滌、4%多聚甲醛固定和1%BSA封閉后，加入β-catenin一抗(1∶200)過夜孵育。次日PBS洗滌后，37 ℃避光孵育熒光二抗(1∶100),1 h后加入DAPI(1∶400)，37 ℃避光孵育15 min。PBS洗滌后甘油封片，立即在激光共聚焦熒光顯微鏡(Leica TCS SP5,Germany)下觀察β-catenin的分布。

2 結(jié) 果

2.1幽門螺桿菌對胃癌細(xì)胞遷移的影響 在空白對照組中，穿過Transwell小室的GES-1細(xì)胞為(116.4±23.5)個。而實驗組穿過Transwell小室的GES-1細(xì)胞數(shù)目增至(170.2±36.7)個，二者比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A。陽性對照組穿過Transwell小室的GES-1細(xì)胞為(241.5±47.3)個，明顯多于實驗組。對于胃癌細(xì)胞SGC-7901出現(xiàn)類似的變化趨勢，TGF-β刺激后SGC-7901細(xì)胞遷移數(shù)目增加到(384.6±85.2)個。而幽門螺桿菌刺激SGC-7901細(xì)胞后，遷移數(shù)目由(231.9±51.0)個上升到(318.5±68.1)個，兩組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B、C。

A：GES-1細(xì)胞；B：SGC-7901細(xì)胞(標(biāo)尺50 μm)；C：細(xì)胞平均遷移數(shù)量

圖1幽門螺桿菌對細(xì)胞遷移的影響

2.2幽門螺桿菌對胃癌細(xì)胞E-cadherin和N-cadherin表達(dá)的影響 由圖2可知，幽門螺桿菌SS1菌株刺激GES-1細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞后，E-cadherin表達(dá)量均明顯降低。在GES-1細(xì)胞中，實驗組(SS1)E-cadherin的相對表達(dá)量是空白對照組的(0.732±0.063)倍，二者比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2B；而與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。SGC-7901細(xì)胞E-cadherin變化趨勢與GES-1細(xì)胞相似，幽門螺桿菌SS1菌株作用后，E-cadherin的相對表達(dá)量下降至0.741±0.135，而陽性對照組的E-cadherin相對表達(dá)量為0.622±0.091，兩組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與E-cadherin變化趨勢不同，幽門螺桿菌SS1菌株刺激GES-1細(xì)胞后N-cadherin的表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)，而刺激SGC-7901細(xì)胞后，N-cadherin相對表達(dá)量上升至1.32±0.165，高于空白對照組。而陽性對照組為1.28±0.057,與實驗組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A：Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)水平；B：E-cadherin的相對表達(dá)量；C：N-cadherin的相對表達(dá)量

圖2幽門螺桿菌對E-cadherin和N-cadherin表達(dá)影響

2.3幽門螺桿菌對胃癌細(xì)胞間充質(zhì)蛋白表達(dá)的影響 以幽門螺桿菌作用于GES-1細(xì)胞后，Twist的相對表達(dá)量顯著增加，是空白對照組的(1.94±0.091)倍，二者比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而陽性對照組相對表達(dá)量為2.15±0.15，與實驗組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在SGC-7901細(xì)胞的Twist的變化和GES-1細(xì)胞相似，幽門螺桿菌作用SGC-7901細(xì)胞后，Twist的表達(dá)水平顯著增加，但與實驗組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與Twist變化趨勢不同，幽門螺桿菌和TGF-β作用于兩種細(xì)胞后，GES-1細(xì)胞Vimentin相對表達(dá)量無明顯變化，而SGC-7901細(xì)胞中實驗組和陽性對照組顯著增加，分別為空白對照組的(1.48±0.86)倍和(1.42±0.91)倍，兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。GES-1細(xì)胞接受幽門螺桿菌刺激后，MMP-9的表達(dá)量均高于空白對照組和陽性對照組。而SGC-7901細(xì)胞中實驗組和陽性對照組MMP-9的表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯上升，且二者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)院意義(P>0.05)，見圖3。

2.4幽門螺桿菌對胃癌細(xì)胞β-catenin分布的影響 經(jīng)幽門螺桿菌SS1菌株刺激后，GES-1細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞膜上的β-catenin顯著減少(黃色箭頭)，而細(xì)胞核中的β-catenin明顯增加(紅色箭頭)，且分布變化趨勢與對應(yīng)的陽性對照組相似，見圖4。

A：Western blot檢測間充質(zhì)蛋白的表達(dá)水平；B：Twist相對表達(dá)量；C：Vimentin的相對表達(dá)量；D：MMP-9的相對表達(dá)量

圖3幽門螺桿菌對間充質(zhì)蛋白的表達(dá)影響

A：GES-1細(xì)胞；B：SGC-7901細(xì)胞(標(biāo)尺5 μm)

圖4幽門螺桿菌對胃癌細(xì)胞β-catenin分布的影響

3 討 論

幽門螺桿菌是一類黏附于胃幽門的微需氧型革蘭陰性菌,與胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已被WHO視為第一類生物致癌因子[13]。國內(nèi)外關(guān)于于幽門螺桿菌的研究主要集中于胃炎和胃癌的致病機制，而忽視了它對胃癌細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。幽門螺桿菌的致病因子有尿素酶、空泡毒素、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白和黏附素，此外它還可刺激機體釋放環(huán)氧化酶(COX)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子。其中，細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白Cag是幽門螺桿菌最重要致病因子。據(jù)CagA可將幽門螺桿菌分為CagA+和CagA-兩大類，陽性菌株的毒力遠(yuǎn)超過陰性菌株。Cag和上述致病因子不僅能誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞發(fā)生癌變，而且能調(diào)控胃上皮細(xì)胞的增殖和凋亡[14]。幽門螺桿菌能刺激G細(xì)胞分泌胃泌素，并且與其受體CCK-β 結(jié)合，促進上皮細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌可通過雙重方式調(diào)控上皮細(xì)胞凋亡。一方面，幽門螺桿菌與宿主上皮細(xì)胞結(jié)合后，釋放前列腺素，激活PPARγ，抑制細(xì)胞凋亡[15]。而另一方面，幽門螺桿菌還會分泌尿素酶和空泡毒素，活化Caspase-3或FAS，促進凋亡[16]。

近年來不少學(xué)者證實幽門螺桿菌可影響胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。 CagA能誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞酪氨酸磷酸化和骨架重排，誘導(dǎo)機體釋放炎癥因子，進而促進細(xì)胞遷移。O′CONNOR等[17]發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌感染的患者血清可溶性E-cadherin的水平明顯低于健康人群，而感染CagA+菌株的患者可溶性E-cadherin明顯低于CagA-菌株患者。與O′CONNOR的研究相似，YIN等[18]分別以Hp.60190(CagA+)和Hp.Tx30a(CagA-)菌株刺激AGS細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)前者刺激后AGS細(xì)胞的Snail 1、Slug和Vimentin的RNA水平明顯高于后者。幽門螺桿菌還可分泌TNF-α調(diào)節(jié)蛋白(TNF-α induced proteins,TIPα)，活化MEK/ERK信號途徑，抑制MKN-1細(xì)胞Vimentin的表達(dá)，促進細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變和絲狀偽足的形成，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT[19]。關(guān)于幽門螺桿菌誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT機制仍不清楚，最近有研究發(fā)現(xiàn)CagA的羧基末端能與SHP2 和 PAR1/MARK2結(jié)合，使谷氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸(EPIYA)模體磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。但LEE等[20]發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌可抑制GSK-3表達(dá)，進而上調(diào)Snail和Snail和β-catenin表達(dá)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT。Hp.SS1菌株是由澳大利亞LEE團隊馴化而來，是CagA+和VacA+菌株，具有很強的黏附能力[21]。 本研究以Hp.SS1菌株分別刺激胃癌和胃上皮細(xì)胞，分析胃癌細(xì)胞遷移能力及EMT相關(guān)標(biāo)志物的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hp.SS1菌株使胃癌細(xì)胞的β-catenin向核內(nèi)易位，抑制E-cadherin的表達(dá)，促進N-cadherin、Twist和MMP-9的表達(dá)，促進胃癌細(xì)胞的遷移。本研究在YIN等[18]研究基礎(chǔ)上，通過體外模擬幽門螺桿菌與胃癌細(xì)胞的相互作用，并與趨化因子TGF-β相比較，證實了幽門螺桿菌可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT。最近CHOI等[22]發(fā)現(xiàn)早期為患者行幽門螺桿菌根除治療，患者的Twist、Snail、Slug 和 Vimentin的mRNA水平下降，而E-cadherin的mRNA水平上升。由此可知，對于合并幽門螺桿菌感染的胃癌患者行幽門螺桿菌根除治療不僅能改善患者癥狀，還可能會抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。