外源H2S緩解黃瓜種子萌發過程中干旱脅迫傷害的生理機制

牟雪姣，張遠兵，吳 燕，張 強

(安徽科技學院 建筑學院，安徽蚌埠 233100)

黃瓜(CucumissativusL.) 是世界各國普遍栽培的重要蔬菜作物之一，其消費量大，種植面積逐年增加。黃瓜屬淺根性作物，不同生育時期需水量都很高，發芽期要求更高，水分不足則發芽緩慢，整齊度差。干旱是黃瓜育苗階段存在的主要問題，也是影響黃瓜產量的重要因素之一[1-2]。因此，探索外源物質對黃瓜干旱脅迫的緩解作用，提高黃瓜對干旱脅迫的適應性已成為黃瓜生產栽培中亟待解決的重要問題之一。

硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化氮(Nitric oxide，NO)和一氧化碳(Carbon monoxide, CO)之后的第3種氣體信號分子，廣泛分布于生物體內[3]。H2S在植物的正常生理和逆境脅迫中均發揮著非常重要的作用，能夠顯著提高植物對非生物脅迫的抗性[4]。近年來，關于外源H2S提高植物抗旱性的研究已經取得一定進展。有研究表明，H2S可以通過上調超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等抗氧化酶的活性來降低甘薯幼苗中H2O2的水平，進而提高其抗旱性[5]；也可以通過調控谷胱甘肽和抗壞血酸代謝來減緩干旱脅迫對小麥幼苗造成的氧化傷害[6]；H2S還可以誘導干旱脅迫條件下蠶豆和鳳仙花植株葉片的氣孔關閉，減少水分蒸騰，以緩解干旱脅迫[7]。此外，外源H2S還能夠通過提高最大光化學效率(Fv/Fm)、光化學猝滅系數(qP)和電子傳遞速率(ETR)等減輕干旱脅迫對小麥植株光系統Ⅱ的損傷，保證光合作用的順利進行[8]。但外源H2S對萌發生長期黃瓜干旱脅迫緩解作用的研究迄今尚未見報道。

因此，本試驗以黃瓜種子為材料，采用聚乙二醇(PEG-6000)模擬干旱脅迫，從生長指標、質膜透性和膜脂過氧化、滲透調節物質的質量分數及水解酶和抗氧化保護酶活性等角度，研究外源H2S對萌發生長期黃瓜干旱脅迫的緩解效果與作用機制，為H2S作為抗旱誘導劑在黃瓜生產上的推廣應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料培養與處理

供試黃瓜品種‘新津研四號’由天津市中天種業有限公司提供。挑選籽粒飽滿、大小均勻且無病蟲傷害的黃瓜種子，用質量分數為0.1%氯化汞溶液消毒10 min，再用自來水和蒸餾水分別沖洗3次，晾干。將晾干后的黃瓜種子用蒸餾水或1 mmol·L-1NaHS溶液(H2S的供體)于25 ℃下浸種8 h，隨后，將種子轉入墊有3層濾紙的培養皿中，每皿20粒。分別向皿中加入蒸餾水或10% PEG6000溶液6 mL，然后將皿置于PYX-250S-A 型生化培養箱中，在25 ℃進行培養。每天定時向皿中補充0.5 mL(水分蒸發量)蒸餾水，以維持試驗條件的恒定。試驗共設4個處理，分別為①對照組(CK)：蒸餾水浸種，蒸餾水培養；②PEG：蒸餾水浸種，PEG6000培養；③NaHS：NaHS浸種，蒸餾水培養；④PEG+NaHS：NaHS浸種，PEG6000培養。每個處理重復3次，每個重復5皿，在處理的第2天統計發芽勢，第3天統計發芽率，第4天進行生理和生化指標的測定，第6天測量胚軸長、根長及鮮質量。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長指標測定 以芽長≥1/2 種子長度作為發芽標準，按下式計算發芽勢和發芽率：

發芽勢=規定天數內發芽種子粒數/供試種子總粒數×100%

發芽率=全部發芽種子粒數/供試種子粒數×100%

每皿抽取10株，用直尺測量胚軸長和根長；用蒸餾水洗凈并用濾紙吸干表面水分后，用萬分之一天平稱量鮮質量。

1.2.2 水解酶活性測定 淀粉酶活性的測定采用3，5 - 二硝基水楊酸比色法[9]；酯酶活性的測定采用固蘭B鹽顯色法[10]。

1.2.3 抗氧化酶同工酶電泳 將1 g樣品與3 mL提取液[0.05 mmol·L-1pH 7.8磷酸緩沖液，內含5 mmol·L-1β-巰基乙醇和質量分數為2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)]混合于研缽中，再加少量石英砂，冰浴研磨至勻漿，4 ℃離心(10 000 ×g，30 min)，上清液為待測酶液。

抗氧化酶同工酶電泳參照王松華等[11]的方法。其中SOD(EC1.15.1.1) 同工酶電泳分離膠質量分數為10%，濃縮膠質量分數為5%，用氯化硝基四氮唑藍(NBT)作為染色劑；過氧化物酶(POD；EC1.11.1.7)和CAT(EC1.11.1.6) 的同工酶電泳分離膠質量分數為7%，濃縮膠濃度為5%，其中POD同工酶電泳用醋酸聯苯胺染色，CAT同工酶電泳用質量分數為2%鐵氰化鉀和2%氯化高鐵染色。

1.2.4 根質膜透性測定 用伊文思藍染色法測定根的質膜透性[12]。將根用0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液洗凈，濾紙吸干，放入伊文思藍染液(0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液，pH 5.6，含質量分數0.025%的伊文思藍)中染色10 min，再用0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液漂洗至無藍色析出，最后用濾紙吸干表面并拍照記錄試驗結果。

1.2.5 其他生理指標的測定 電解質滲漏率和丙二醛(MDA)質量摩爾濃度的測定參照Michael等[13]的方法；可溶性糖和游離脯氨酸(Pro)質量分數的測定分別采用蒽酮比色法和茚三酮顯色法，具體參照李合生等[14]的方法。

1.3 數據統計分析

采用DPS 7.05軟件中的Duncan’s新復極差法對試驗數據進行差異顯著性分析， 用OriginPro 9.2軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 H2S對黃瓜種子萌發生長的影響

發芽率、發芽勢、根長、胚軸長和鮮質量等是反映植株生長狀況的重要指標。由表1可以看出，PEG脅迫處理的發芽率、發芽勢、根長、胚軸長和鮮質量等指標均顯著低于CK(P<0.05)，表明干旱脅迫對黃瓜種子的萌發生長有顯著的抑制作用；NaHS單獨處理的發芽率和發芽勢與CK相比差異并不顯著，但其根長、胚軸長和鮮質量均顯著優于CK(P<0.05)，說明NaHS處理對黃瓜種子的生長有一定的促進作用；與PEG脅迫處理相比，NaHS+PEG處理的各項指標均顯著提高，說明外源H2S能顯著緩解干旱脅迫對黃瓜種子萌發生長的抑制作用。

表1 H2S對干旱脅迫下黃瓜種子萌發生長的影響Table 1 Effects of H2S on germination and growth of cucumber seeds under drought stress

注:數據為3次測量的“平均值±標準差”。同列不同小寫字母表示處理間差異達0.05顯著水平。

Note:Data are “means ±standard deviation”(n = 3).Different lowercase letters in the same columns indicate significant difference among different treatments at 0.05 level.

2.2 H2S對質膜透性和膜脂過氧化的影響

干旱脅迫下，植物體內會產生大量的自由基，導致細胞膜系統嚴重損傷，膜脂過氧化產物MDA大量累積，同時，質膜通透性增大，電解質大量外滲。因此，可通過MDA質量摩爾濃度變化判斷植株的膜脂過氧化水平；根據電解質滲漏率及根染色情況判定質膜的完整性。

從圖1-A、B可以看出，與CK相比，PEG脅迫處理的電解質滲漏率和MDA質量摩爾濃度均顯著上升，而NaHS處理則無明顯變化；PEG+NaHS處理的電解質滲漏率和MDA質量摩爾濃度盡管較CK顯著升高，但顯著低于PEG脅迫處理。從圖1-C可以看出，各處理的根經伊文思藍染色后，均呈現明顯的藍色，其中PEG脅迫處理的根顏色較CK明顯加深，NaHS處理的根顏色與CK相差不大，而PEG+NaHS處理的根顏色比CK略深，但明顯淺于PEG脅迫處理。圖1表明，H2S的供體NaHS對正常生長環境條件下黃瓜的質膜透性和膜脂過氧化無明顯影響，但對干旱脅迫條件下黃瓜質膜透性的增大和膜脂過氧化水平的加重有顯著的抑制作用。

2.3 H2S對滲透調節物質質量分數的影響

Pro和可溶性糖是植物體內重要的滲透調節物質，它們能維持細胞膨壓，并有利于保持膜結構的完整[15]。由圖2可知，與CK相比，其他各處理均能顯著提高黃瓜種子的Pro和可溶性糖質量分數(P<0.05)，但以PEG+ NaHS處理的Pro和可溶性糖質量分數增加幅度最大，分別比CK提高43.78%和16.29%，表明外源H2S能夠在黃瓜種子自身響應干旱脅迫的基礎上進一步提高黃瓜種子中Pro和可溶性糖質量分數，以提升黃瓜種子對干旱脅迫的抗性。

2.4 H2S對水解酶活性的影響

淀粉酶和酯酶都是黃瓜種子萌發過程中不可或缺的重要酶類。他們能夠為植物胚根和胚芽生長及器官建成提供物質基礎和能量來源。從圖3可以看出，淀粉酶和酯酶活性均以PEG+NaHS處理最高，其次為NaHS處理，再次為PEG脅迫處理，而CK處理的淀粉酶和酯酶活性均最低，各處理間2種酶活性的差異均達顯著水平(P<0.05)，說明外源H2S能夠顯著增強黃瓜種子萌發期間淀粉酶和酯酶的活性，進而提高其對干旱脅迫的適應性。

A.電解質滲漏率Electrolyte leakage rate;B.MDA質量摩爾濃度MDA molality；C.根質膜透性Plasma membrane integrity of roots

圖上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。下同 Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level．The same below

圖1外源H2S對黃瓜種子質膜透性和膜脂過氧化的影響
Fig.1EffectsofexogenousH2Sonplasmamembranepermeabilityandmembranelipidperoxidationduringgerminationandgrowthofcucumberseeds

2.5 H2S對抗氧化酶同工酶的影響

SOD、POD和CAT是細胞抵御活性氧傷害的重要保護酶系統，可以清除植物體內多余的活性氧，抑制膜脂過氧化作用。由圖4-A可知，SOD同工酶有4條酶帶，與CK相比，其他各處理的酶帶均變寬，亮度增強，以PEG+NaHS處理最為明顯；由圖4-B可以看出，POD同工酶帶為2條，與CK相比，其他各處理的POD酶帶均變寬，顏色加深，仍以PEG +NaHS處理變化最為明顯；圖4-C的結果顯示，CAT同工酶僅有1條酶帶，與CK相比，其他各酶帶的寬度及亮度變化趨勢與SOD同工酶相同。圖4結果表明，外源PEG處理或H2S處理均能促進黃瓜種子萌發期間SOD、POD和CAT同工酶的活性，但以PEG+NaHS處理的作用效果最為顯著，說明外源H2S能夠在黃瓜種子自身響應干旱脅迫的基礎上進一步增強其抗氧化防御系統，以減緩干旱脅迫對其造成的損傷。

圖2 滲透調節物質質量分數的變化Fig.2 Changes of substance mass fraction by osmotic adjustment

圖3 水解酶活性的變化Fig.3 Changes of hydrolase activities

A.超氧化物歧化酶 Superoxide dismutase；B.過氧化物酶 Peroxidase；C.過氧化氫酶 Catalase

3 討 論

干旱是影響植物生長發育和形態建成的重要環境因素之一。在干旱脅迫條件下，植株的生長會明顯受到抑制，同時體內會發生明顯的生理和生化變化。一方面，植物細胞內的活性氧會迅速積累，導致膜脂過氧化損傷，細胞膜結構遭到破壞，質膜透性增強；另一方面，滲透調節物質的質量分數和保護酶的活性也會根據脅迫程度的不同發生相應變化[16-17]。本研究中，干旱脅迫顯著抑制黃瓜種子的萌發，并導致質膜損傷和電解質外滲，MDA質量摩爾濃度也顯著增加，類似的結果在胡蘿卜[18]和水稻[19]中均有報道。此外，干旱脅迫也誘導黃瓜種子的適應性調節反應，表現為滲透調節物質質量分數增多，水解性和抗氧化酶活性增強，這與Zhang等[5]和Wegener等[20]的報道一致。

H2S作為一種非常重要的信號分子，在植物逆境脅迫下發揮重要作用，能夠緩解植物體的逆境(干旱脅迫、鹽脅迫、熱激傷害和離子毒害等)傷害，提高植株對逆境的抗性[21]。本研究結果顯示，PEG+NaHS處理組黃瓜種子的發芽勢、發芽率、胚軸長、根長和鮮質量均顯著超過PEG脅迫組，說明H2S 對干旱脅迫下黃瓜種子的萌發生長具有促進作用，這與劉晶等[22]的研究觀點一致。

可溶性糖和脯氨酸等滲透調節物質的積累有利于維持干旱脅迫下植物細胞的滲透調節。吳單華等[23]研究證實，外源H2S 能提高干旱脅迫下小麥幼苗可溶性糖和脯氨酸的質量分數，維持干旱脅迫時的滲透水平。本研究中，PEG脅迫組的可溶性糖和脯氨酸質量分數均呈上升趨勢，PEG+NaHS 處理進一步提升黃瓜種子的可溶性糖和脯氨酸的質量分數，使干旱脅迫條件下黃瓜種子的細胞膜系統穩定性得到維持，避免膜結構的破壞和細胞脫水，這是H2S增強黃瓜種子抗旱能力的首要因素。

種子在萌發期間需要許多營養物質和能量以維持其旺盛的生命活動[24]，這些養分和能量大多來自種子中淀粉、脂肪等貯藏物質的轉化和利用，而此過程離不開淀粉酶、酯酶等水解酶的催化作用。Huang等[12]研究表明，外源H2S可使鎘脅迫下小麥種子淀粉酶和酯酶活性顯著增強；Zhang等[25-26]研究證實，H2S對小麥Cu2+和Al3+脅迫的緩解作用是由于H2S 提高了小麥淀粉酶同工酶和酯酶同工酶的活性。本試驗結果表明，外源H2S能顯著提高干旱脅迫條件下黃瓜種子淀粉酶和酯酶的活性，以促進貯藏物質的水解，滿足黃瓜種子萌發及生長所需的重要營養物質，這是H2S提高黃瓜種子對干旱脅迫抗性的一個關鍵環節。

SOD、CAT和POD等是植物體內重要的抗氧化酶，它們協調作用，能有效清除植物體內的活性氧和過氧化物，緩解各種非生物脅迫對植物的損害[27]。Jin等[28]研究表明，外源H2S可刺激植物體內與干旱相關轉錄因子的表達，以調節活性氧代謝，并提高植株體內的抗氧化酶水平。本試驗中，PEG脅迫組的SOD、CAT和POD水平均較CK明顯升高，這是植物保護酶系統應激反應的表現；PEG+NaHS處理組的SOD、CAT和POD活性較PEG脅迫組進一步提高，并有效抑制了PEG脅迫下MDA質量摩爾濃度的增加及電解質滲漏率和質膜透性的增強，表明外源H2S能通過提高黃瓜種子的抗氧化酶水平，有效清除自由基，從而緩解了干旱脅迫導致的膜脂過氧化傷害，這是H2S提高黃瓜種子對干旱脅迫適應性的又一重要機制。

然而，植物細胞對干旱脅迫的響應是一個非常復雜的過程，可能會有其他信號物質的參與，也會涉及許多復雜的信號轉導通路。外源H2S對黃瓜種子萌發期間干旱脅迫的緩解作用絕不僅限于上述機制，必然還包括基因表達及代謝調控等更為復雜的生理生化過程，這些都還有待于進一步深入研究。

4 結 論

干旱脅迫對黃瓜種子的萌發有明顯的抑制作用，并導致膜質過氧化和質膜透性增加。外源H2S 可通過改善黃瓜種子的滲透調節能力，提高水解酶活性，提升SOD、CTA和POD抗氧化保護酶水平來增強其對干旱脅迫的適應性，促進干旱脅迫下黃瓜種子的萌發。