原位惡性黑素瘤單細胞分離及拉曼光譜測定

彭洋 陳挺杰 張婧秋 樊姣榮 朱佳 丁曉嵐 李航

100034北京大學第一醫院皮膚科 皮膚病分子診斷北京市重點實驗室（彭洋、陳挺杰、張婧秋、李航）；北京大學微電子學系微米/納米加工技術國家級重點實驗室（樊姣榮、朱佳）；北京大學人民醫院皮膚科（丁曉嵐）

惡性黑素瘤（簡稱惡黑）發病率逐年升高，侵襲性強、病死率高，嚴重威脅患者健康和生命[1]，根據侵襲程度可分為原位惡黑和侵襲性惡黑[2]。早期診斷、早期治療能夠顯著改善惡黑患者的預后[3?5]。早期原位惡黑細胞在表皮基底層散在增生，不呈巢，因此通過消化原位惡黑標本分離所得的細胞混懸液所含黑素瘤細胞比例較低，尚需進一步純化才能獲得可供研究的高濃度黑素瘤細胞。黑素來源細胞（黑素瘤細胞、黑素細胞）在細胞懸液狀態下的形態特征，如細胞直徑、胞質顆粒化程度（即光鏡下的胞質非均質化程度，可能與細胞內色素顆粒、黑素小體、細胞代謝過程中的產物、細胞器等結構有關）與其他來源的細胞是否存在差異，目前尚缺乏此類研究。本研究使用標準化試劑盒消化原位惡黑標本獲得的細胞混懸液，嘗試依據細胞的大小、形態、胞質成分、顆粒化程度等指標的差異，區分角質形成細胞與黑素（瘤）細胞，并據此探索一套分離、純化原位惡黑中活性黑素（瘤）細胞的技術平臺，為后續從單細胞層次研究原位惡黑相關的發病機制、細胞學改變以及新的鑒別診斷指標提供新線索。

一、對象與方法

1.對象：北京大學第一醫院皮膚科2015年10月至2016年4月確診的9例原位惡黑、5例侵襲性惡黑以及5例交界痣患者。患者均接受了原發灶切除手術，腫瘤標本行組織病理檢查。本研究通過北京大學第一醫院醫學倫理委員會批準（批號：2014[702]），患者均簽署知情同意書。

2.細胞系與試劑：黑素細胞系（PIG1）由美國Loyola University的Caroline Le Poole教授饋贈，惡黑細胞系（A375）由北京大學腫瘤醫院腎癌與黑色素瘤科郭軍、孔燕、斯璐教授饋贈，永生化角質形成細胞系（HaCaT）由北京大學第一醫院皮膚科吳艷教授饋贈。胎牛血清、青鏈霉素、HMGS、Medium 254培養基（美國Gibco公司），DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液（PBS，美國HyClone公司），臺盼藍（美國Sigma公司），RECELL表皮細胞分離試劑盒（澳大利亞Avita公司），S100抗體、AE1/AE3抗體、Melan?A抗體、山羊抗小鼠IgG抗體（美國OriGene公司），羊血清工作液、二氨基聯苯胺顯色液（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

3.細胞培養：A375細胞與PIG1細胞分別在含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、1%HMGS的Medium 254培養基中，37℃、100%濕度、5%CO2條件下培養。HaCaT細胞于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養基中，37℃、100%濕度、5%CO2條件下培養。

4.細胞混懸液制備：術中留取常規病理檢查所需腫瘤組織后，將剩余腫瘤組織按RECELL表皮細胞分離試劑盒標準操作流程進行消化處理[6]：將腫瘤組織放入專用反應盒中，加入試劑盒專用消化酶消化60 min，人工剝離表皮，沖洗并收集表皮細胞混懸液。分離后取少量細胞做臺盼藍染色驗證細胞活性，分離15、30、45、60 min時存活率分別為83.3%、70%、50%、10%，即分離后可獲得高比例的活性表皮細胞，15～60 min內細胞存活率隨著時間延長而降低。

5.涂片離心及免疫細胞化學鑒定：每份標本分別取0.5ml細胞混懸液在cytospin3型自動涂片離心機中以1 600 r/min（離心半徑10 cm）離心涂片2 min，使細胞貼附于陽離子防脫玻片上，免疫細胞化學兩步法[7]對細胞涂片分別進行S100、Melan?A和AE1/AE3免疫細胞化學鑒定。丙酮固定、雙氧水和羊血清工作液處理后分別加入鼠源抗S100、Melan?A和AE1/AE3抗體，并以PBS作為對照，于4℃孵育12h，在復溫并洗脫之后加入山羊抗小鼠IgG抗體，于37℃孵育30 min，隨后滴加二氨基聯苯胺顯色液顯色并以蘇木精染色，最后經過脫色脫水以及二甲苯立體化和樹脂封片后置于顯微鏡下觀察，每份標本分析100個細胞，分別統計其中黑素來源細胞（S100和/或melan?A陽性）和角質形成細胞（AE1/AE3陽性）的比例。

6.細胞形態分析：在細胞懸液狀態下，對A375細胞、PIG1細胞、HaCaT細胞、原位惡黑分離細胞、侵襲性惡黑分離細胞、交界痣分離細胞進行形態學觀察和測量。每種細胞系及每份來自患者的標本分析100個細胞，統計細胞直徑、胞質顆粒化程度（非均質化區域占胞質面積的百分比）。

7.細胞純化：利用有限稀釋法[8]分別將來源于5例原位惡黑患者的表皮單細胞分離到96孔板中，依據胞質顆粒化程度高低從表皮單細胞中純化黑素來源細胞，具體方法為：在光鏡下觀察每一孔板中單細胞的胞質顆粒化程度，收集胞質高顆粒化的細胞（非均質化區域占胞質面積＞50%），每份標本共收集200個細胞。將純化所得細胞離心涂片和S100免疫細胞化學染色，每份標本分析100個細胞，統計評估純化后黑素來源細胞（S100陽性）的比例，計算純化效率。

8.原位惡黑細胞的拉曼光譜測定：為進一步研究純化得到的原位惡黑細胞的拉曼光譜特征（反映腫瘤細胞膜表面的微觀結構及介電特征），采用電化學自組裝生長的金納米顆粒作為表面增強拉曼活性襯底，通過金納米顆粒與細胞膜緊密結合，增強細胞膜表面生物分子的拉曼信號，從而實現單細胞水平的拉曼光譜檢測。分別將從1例原位惡黑和1例交界痣患者標本分離得到的原位惡黑細胞和交界痣細胞懸液滴于金納米顆粒表面增強拉曼活性襯底，在光鏡下確定細胞位置，利用顯微共焦激光拉曼光譜儀掃描得到細胞膜表面的拉曼強度分布，以拉曼峰譜表征不同類型細胞的細胞膜表面生物分子特征。拉曼光譜儀檢測參數：激光波長633 nm，功率5 mW，50倍物鏡。

二、結果

1.黑素來源細胞分離效率：見表1。原位惡黑、侵襲性惡黑、交界痣標本間S100陽性率、Melan?A陽性率差異有統計學意義（均P＜0.05），原位惡黑中S100陽性率低于侵襲性惡黑（t=7.2，P＜0.05），而與交界痣間差異無統計學意義（t=2.1，P＞0.05）。原位惡黑Melan?A陽性率低于侵襲性惡黑（t=9.2，P＜0.05），高于交界痣（t=9.0，P＜0.05）。3種標本來源細胞AE1/AE3陽性率差異無統計學意義。

表1 原位惡性黑素瘤、侵襲性惡性黑素瘤、交界痣分離所得細胞混懸液中S100、Melan?A、AE1/AE3陽性率（±s，%）

表1 原位惡性黑素瘤、侵襲性惡性黑素瘤、交界痣分離所得細胞混懸液中S100、Melan?A、AE1/AE3陽性率（±s，%）

細胞來源原位惡性黑素瘤侵襲性惡性黑素瘤交界痣F值P值例數9 5 5 S100 14.1±1.5 22.0±2.7 11.8±1.9 38.5＜0.05 Melan?A 10.2±1.7 17.4±1.1 3.2±0.8 127.8＜0.05 AE1/AE3 74.7±5.0 71.2±3.3 76.0±5.8 1.3＞0.05

2.黑素瘤細胞形態特征分析：原位惡黑、侵襲性惡黑、交界痣標本中分離所得的細胞混懸液中，黑素來源細胞與角質形成細胞直徑之間差異均無統計學意義（P＞0.05），而顆粒化程度間差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。A375、PIG1、HaCaT細胞系細胞直徑差異無統計學意義（P＞0.05）；顆粒化程度差異有統計學意義（P＜0.05），A375、PIG1細胞胞質顆粒化程度均高于HaCaT細胞（t值分別為18.0、17.0，P＜0.05）。見表3。

表2 不同來源的黑素（瘤）細胞與角質形成細胞直徑、胞質顆粒化程度比較（±s）

表2 不同來源的黑素（瘤）細胞與角質形成細胞直徑、胞質顆粒化程度比較（±s）

細胞黑素（瘤）細胞角質形成細胞t值P值原位惡性黑素瘤（9例）直徑（μm）15.5±2.0 15.2±3.1 0.6＞0.05顆粒化程度（%）67.1±11.4 46.2±11.5 8.6＜0.05侵襲性惡性黑素瘤（5例）直徑（μm）15.8±2.2 16.1±2.6 0.4＞0.05顆粒化程度（%）75.6±11.2 40.0±11.5 11.1＜0.05交界痣（5例）直徑（μm）14.5±2.2 15.2±2.8 1.0＞0.05顆粒化程度（%）65.2±11.9 40.8±12.6 7.0＜0.05

表3 三種細胞系直徑與胞質顆粒化程度比較（±s）

表3 三種細胞系直徑與胞質顆粒化程度比較（±s）

注：n=299。a與HaCaT胞質顆粒化程度比較差異有統計學意義，P＜0.05

細胞系A375細胞PIG1細胞HaCaT細胞F值P值直徑（μm）15.2±1.6 15.0±1.8 14.7±1.3 0.6＞0.05顆粒化程度（%）46.8±8.0a 44.4±10.8a 4.4±5.1 205.2＜0.05

3.原位惡黑細胞純化效率：原位惡黑中的黑素瘤細胞比例純化前為（13.4±0.5）%，純化后提高到（22.2±1.0）%，純化前后差異有統計學意義（t=8.0，P＜0.05），平均純化效率為165.7%。

4.原位惡黑細胞拉曼光譜特征：電鏡下，襯底元件表面均勻分布金納米顆粒，細胞貼附在該襯底元件表面（圖1）。單細胞拉曼光譜檢測結果顯示，原位惡黑細胞和交界痣細胞的拉曼光譜峰值區域不重疊（圖2）。

三、討論

從原位惡黑標本中分離并純化具有活性的黑素瘤細胞是研究原位惡黑的前提。有文獻報道，利用黑素細胞特異性培養技術可逐步純化黑素細胞[9]。由于腫瘤細胞基因組不穩定，在經過多次增殖、傳代后，腫瘤細胞可能產生與原發疾病不相關的基因突變或染色體變異，干擾后續實驗分析。既往還曾利用膠原酶、胰酶消化皮膚制備細胞懸液，然而制備過程中，處理時間、溫度、消化酶的濃度難以精確控制，實驗過程很容易對細胞造成損傷，或者降低分離效率[10]。近年RECELL試劑盒被批準臨床應用，該標準試劑盒提供了專用的反應裝置和消化酶，可高效地獲得具有活性的表皮細胞混懸液，已應用于移植表皮單細胞治療燒傷和白癜風等[11?12]。

本文采用RECELL試劑盒分離得到的表皮單細胞懸液，主要包括角質形成細胞和黑素細胞（在腫瘤標本中還包含黑素瘤細胞）。利用免疫細胞化學染色區分這兩種細胞并結合相應細胞系進行形態學分析，我們觀察到角質形成細胞和黑素（瘤）細胞在單細胞懸液狀態下，存在一定的形態學差異，主要體現在黑素（瘤）細胞胞質的顆粒化程度高于角質形成細胞。經過有限稀釋法分選出胞質高顆粒化程度的細胞后，黑素瘤細胞純度有顯著提高，提示利用黑素（瘤）細胞與角質形成細胞在胞質顆粒化程度方面的差異進行形態區分具有可行性。

圖1 金納米顆粒表面增強拉曼活性襯底和細胞貼附其表面的電鏡圖片 1A：襯底元件表面均勻分布金納米顆粒（紅色箭頭）；1B：細胞貼附在該襯底元件表面（黃色箭頭）

圖2 原位惡性黑素瘤及交界痣細胞拉曼光譜 原位惡性黑素瘤細胞和交界痣細胞的拉曼光譜峰值區域不重疊。左上角細胞圖像為所測單細胞的顯微鏡下形態

受限于有限稀釋法對細胞分選的效率較低，最終純化得到的細胞總量僅為102個左右，而免疫熒光共染過程中存在多次洗脫抗體的操作，不可避免地損失大量細胞，實驗可行性較差。我們采用離心涂片聯合免疫細胞化學染色鑒定不同來源的細胞，從而避免細胞損失。細胞免疫分子標記選擇方面，我們在確定標本分別為原位惡黑、侵襲性惡黑、交界痣的前提下，分別選取S100、Melan?A、AE1/AE3鑒定相應標本中的黑素來源細胞和角質形成細胞。不可否認僅選用S100和Melan?A兩種黑素細胞相關免疫標記進行檢測，會遺漏部分特殊免疫表型的黑素瘤細胞，導致對黑素來源細胞游離狀態的形態分析存在偏倚。這也可能是利用本純化方案僅可有限提高黑素（瘤）細胞比例，仍無法純化得到高純度黑素（瘤）細胞的原因。通過反復純化或借助流式細胞儀對細胞胞質顆粒化差異的自動分選均有望進一步提高純化效率，以獲取高純度黑素（瘤）細胞用于后續細胞生物學實驗。

拉曼散射效應是一種由分子振動和晶格振動導致的非彈性散射，可以表征特定的化學基團，其不同的峰譜對應生物分子中不同的化學鍵，而峰值強度對應于這個化學鍵的數量。由于不同生物樣品表面化學基團成分存在差異，可檢測到不同的拉曼光譜特征，從而可以實現對生物樣品的識別和檢測，目前已經被廣泛應用于各種生物樣品研究。在腫瘤研究中，可用于區別腫瘤細胞和正常細胞[13]。近期也有研究初步證明了其在鑒別惡黑和良性色素痣中的價值[14]，我們的實驗完成了對原位惡黑單細胞的拉曼光譜檢測，為利用這項技術鑒別良惡性黑素細胞奠定了基礎。

我們利用標準化的表皮消化技術，從原位惡黑標本中分離得到了活性表皮細胞，結合細胞免疫化學染色、細胞形態分析和有限稀釋法，分選出胞質高顆粒化程度的細胞，從而提高了黑素瘤細胞的比例，并初步研究了其拉曼光譜特征。研究結果提示，胞質顆粒化程度可作為重要的分選指標，用于發展并完善黑素（瘤）細胞的純化技術，有望解決原位惡黑細胞獲取的技術瓶頸，為進一步研究原位惡黑的細胞遺傳學和生物學特征提供可能。