煙曲霉對人急性單核細胞白血病細胞系產生腫瘤壞死因子α、活化信號分子p38絲裂原活化蛋白激酶的影響

童建波 杜蕾蕾 曾榮 王麗瑋 劉宇甄 段志敏 陳青 李岷

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所 江蘇省皮膚性病分子生物學重點實驗室（童建波、杜蕾蕾、曾榮、王麗瑋、劉宇甄、段志敏、李岷）；江蘇省血液中心（陳青）

由于廣譜抗菌藥物、糖皮質激素和免疫抑制劑的廣泛使用，放療和化療、器官移植以及侵入性治療措施的急劇增加，艾滋病等免疫缺陷性疾病的流行，近年來侵襲性曲霉病的發病率快速上升[1]，致死率可高達50%～95%，而煙曲霉是最常見的致病菌[2]。宿主單核巨噬細胞作為固有免疫中重要的反應細胞，能識別并清除入侵的煙曲霉[3]。本研究旨在探討煙曲霉能否激活人急性單核細胞白血病細胞系（THP?1）的信號分子p38絲裂原活化蛋白（MAPK）及誘導腫瘤壞死因子α（TNF?α）的分泌。

材料和方法

一、 菌株、細胞和主要試劑

煙曲霉Af293（ATCC MYA?4609，CBS 101355）、THP?1細胞株購自美國模式培養物集存庫（ATCC）。兔抗人p38MAPK和磷酸化p38MAPK抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；iTaq通用型SYBR Green預混液（美國Bio?rad公司）；PrimeScript RT Master Mix反轉錄酶試劑盒（日本TaKaRa公司）；TNF?α酶聯免疫吸附試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）；丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）、β-葡聚糖、p38MAPK抑制劑SB2035805（美國Sigma公司）。

二、 細胞培養

煙曲霉Af293在蛋白胨沙氏瓊脂培養基（SDA）上37℃培養3d，收集煙曲霉孢子，經56℃60 min水浴滅活后，配制成不同濃度菌懸液待用。THP?1細胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基培養，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養、傳代。將THP?1細胞制備成2×105個/ml細胞懸液，接種于6孔細胞培養板（每孔2ml）及12孔細胞培養板（每孔1ml），加入100 mg/L PMA刺激48h后，加入106和107CFU/ml滅活煙曲霉菌懸液共培養。

三、 實時熒光定量反轉錄PCR法檢測煙曲霉與THP?1細胞共孵育不同時間點TNF?α mRNA表達水平

106和107CFU/ml煙曲霉與2 × 105/ml THP?1細胞共孵育（106和107CFU/ml煙曲霉組），并設空白對照組（不加任何刺激，僅用培養基處理THP?1細胞）和陽性對照β-葡聚糖組（采用陽性刺激物100 mg/L β-葡聚糖孵育THP?1細胞），分別培養1、3、6h。根據預實驗，刺激6h后TNF?α mRNA表達水平達到最高，繼續延長作用時間后其表達水平開始降低。

根據上述實驗結果，選擇刺激效果最強的6h作為觀察時間，選擇107CFU/ml煙曲霉作為刺激濃度。設置p38MAPK抑制劑SB203580阻斷組，即20 μmol/L SB203580預先與THP?1細胞共培養2h后，再用107CFU/ml煙曲霉、β-葡聚糖或培養基作用6h。同時設立SB203580未阻斷組，即僅采用107CFU/ml煙曲霉、β-葡聚糖或培養基作用THP?1細胞6h，檢測各組TNF?α mRNA表達水平。

采用Trizol法抽提各組THP?1細胞總RNA，按PrimeScript RT Master Mix反轉錄酶試劑盒說明書將1 μg總RNA反轉錄為cDNA。使用實時定量PCR儀7300型（美國ABI公司），采用SYBR green法對目的基因進行擴增。以β肌動蛋白作為內參照，引物TNF?α及β肌動蛋白由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列TNF?α上游5′?CGAGTGAC AAGCCTGTAGC?3′，下游5′?GGTGTGGGTGAGGAG CACAT?3′，β肌動蛋白上游5′?TCTGGCACCACACC TTCTA?3′，下游 5′?AGGCATACAGGGACAGCAC?3′。反應條件：預變性95℃10 min，變性95℃15 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，循環數40。采用2?ΔΔCt法計算目的基因的變化水平。

四、 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測培養上清液中TNF?α含量

107CFU/ml煙曲霉菌懸液（煙曲霉組）、β-葡聚糖（β-葡聚糖組）刺激THP?1細胞24h，同時設立僅培養基孵育THP?1細胞的空白對照組，按照試劑盒說明書檢測培養上清液中TNF?α含量。

五、 Western印跡法檢測p38MAPK和磷酸化p38MAPK的表達

107CFU/ml煙曲霉菌懸液分別作用THP?1細胞15、30、60 min，并設置僅培養基孵育THP?1細胞的空白對照組。收集各組THP?1細胞，裂解細胞，提取總蛋白。等量蛋白的不同樣品梯度十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉至聚偏二氟乙烯膜上。5%牛血清蛋白（BSA）封閉2h，兔抗人單克隆抗體4℃孵育過夜。TBST液洗膜3次，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG第二抗體反應2h，TBST液洗膜3次，增強型化學發光Supersignal?試劑顯色發光，檢測p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平。

六、 統計學處理

結 果

一、 煙曲霉對THP?1細胞TNF?α mRNA水平的影響

煙曲霉刺激THP?1細胞后3、6h，經雙因素方差分析，106和107CFU/ml煙曲霉組、β-葡聚糖組、空白對照組TNF?α mRNA表達水平差異有統計學意義（F=110.983，P＜ 0.001，v=3）。見表1。106和107CFU/ml煙曲霉、β-葡聚糖作用THP?1細胞后，TNF?α mRNA水平在3h出現上升，6h上升更明顯，即THP?1細胞TNF?α mRNA水平隨培養時間延長而增高（F=701.680，P＜ 0.001，v=2）。LSD?t檢驗顯示，刺激后3h，107CFU/ml煙曲霉組和β-葡聚糖組TNF?α mRNA水平顯著高于空白對照組（均P＜0.01），而刺激后 6h，106和 107CFU/ml煙曲霉組及β-葡聚糖組均顯著高于空白對照組（均P＜0.001）。刺激后1、3、6h，106CFU/ml煙曲霉組與β-葡聚糖組間TNF?α mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05）。107CFU/ml煙曲霉作用THP?1細胞6h后，TNF?α mRNA表達水平明顯高于106CFU/ml煙曲霉組及β-葡聚糖組（均P＜0.01）。見表1。

表1 煙曲霉對THP?1細胞腫瘤壞死因子α mRNA表達水平的影響（2?ΔΔCt± s）

表1 煙曲霉對THP?1細胞腫瘤壞死因子α mRNA表達水平的影響（2?ΔΔCt± s）

注：n=3。與同時間點空白對照組比較，aP＜0.01；bP＜0.001

組別106CFU/ml煙曲霉組107CFU/ml煙曲霉組β-葡聚糖組空白對照組刺激后1h 1.75±1.15 1.22±0.78 1.84±0.69 0.93±0.16刺激后3h 7.58±0.28 10.43±0.84a 9.27±1.82a 1.04±0.11刺激后6h 49.42±12.35b 199.18±24.25b 67.63±6.43b 1.19±0.71

二、 煙曲霉對THP?1細胞TNF?α蛋白分泌的影響

107CFU/ml煙曲霉刺激THP?1細胞后24h，煙曲霉組、β-葡聚糖組、空白對照組上清液中TNF?α蛋白含量分別為（6 236.30±437.12）、（3 011.08±312.00）、（132.10± 0.61）ng/L。經單因素方差分析，3組間差異有統計學意義（n=9，F=71.25，P＜0.01）。煙曲霉組和β-葡聚糖組均明顯高于空白對照組（P＜0.01、＜0.05），煙曲霉組高于β-葡聚糖組（P＜ 0.01）。

三、 煙曲霉對THP?1細胞p38MAPK激活的影響

107CFU/ml煙曲霉刺激后30 min，與空白對照組相比，磷酸化p38MAPK蛋白水平已明顯升高，60 min時開始減弱；而p38MAPK蛋白水平在刺激后30 min、1h均無明顯變化。見圖1。

四、p38MAPK信號通路抑制劑SB203580對煙曲霉上調TNF?α mRNA水平的影響

使用SB203580后，煙曲霉組和β-葡聚糖組TNF?α mRNA表達水平均較使用前顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 p38MAPK信號通路抑制劑SB203580對煙曲霉上調THP?1細胞TNF?α mRNA水平的影響（±s）

表2 p38MAPK信號通路抑制劑SB203580對煙曲霉上調THP?1細胞TNF?α mRNA水平的影響（±s）

注：n=3。a與空白對照組比較，P＜0.001；b與未用SB203580阻斷組比較，P＜0.01

組別煙曲霉組β-葡聚糖組空白對照組未用SB203580 187.23±21.62a 62.14±2.36a 1.13±0.36加SB203580 3.83±0.62b 5.26±1.39b 1.08±0.25

討 論

外來病原體入侵機體時，啟動固有性和適應性免疫反應，形成穩固復雜的免疫網絡，清除致病菌。巨噬細胞等固有免疫細胞通過細胞表面或內部的模式識別受體識別暴露于病原微生物表面的病原相關分子模式，啟動快速的炎癥信號轉導通路，分泌大量炎癥細胞因子和趨化因子，觸發細胞的吞噬作用、呼吸爆發等功能，進而啟動適應性免疫反應，促進機體對真菌病原體的清除。作為抗感染免疫反應的第一道防線，單核巨噬細胞對識別、清除入侵的煙曲霉起重要作用[4?5]。TNF?α主要由活化的單核巨噬細胞產生，是炎癥起始階段非常關鍵的炎性細胞因子。體外試驗表明[6]，TNF?α能增強肺泡巨噬細胞對分生孢子的特有吞噬作用以及中性粒細胞對真菌菌絲的破壞作用，拮抗TNF?α作用會導致感染煙曲霉的試驗小鼠死亡率增高、肺部霉菌負荷增高，而TNF?α增效劑提高了其生存率。多項研究顯示[7?8]，接受抗TNF治療的患者更加容易罹患念珠菌病、曲霉菌病、組織胞漿菌病等深部真菌感染。

本研究初步發現，兩種濃度的煙曲霉作用THP?1細胞后，均上調TNF?α mRNA水平，并呈現時間依賴效應。在刺激3h后TNF?α mRNA水平上升，刺激6h后106CFU/ml煙曲霉組mRNA水平約為3h的6.5倍，而107CFU/ml組則升高將近20倍。本研究采用β-葡聚糖作為激活THP?1細胞的陽性對照物，發現其也能誘導出相同的時間依賴效應，刺激6h后TNF?α mRNA水平比3h組上升6.3倍。107CFU/ml煙曲霉作用THP?1細胞24h后，上清液中TNF?α含量明顯升高，表明煙曲霉不僅在mRNA水平誘導THP?1細胞上調TNF?α的轉錄，而且在蛋白水平提高該因子的分泌量。

研究發現[9?10]，在煙曲霉感染過程中，巨噬細胞可以通過其表面的C型凝集素受體1（Dectin?1）、Toll樣受體2（TLR?2）和NOD樣受體2（NOD2）促進TNF?α的釋放。p38MAPK分子是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于大多數細胞內，主要分布于細胞質中，是真核細胞轉導細胞外信號到細胞內引起細胞反應的一類重要信號系統[11]。p38MAPK作為MAPK家族成員之一，當細胞接受適宜刺激后，p38MAPK被激活后可使一些轉錄因子，如轉錄活化因子1（ATF?1）、ATF?2、環磷腺苷效應元件結合蛋白及轉錄激活蛋白的絲氨酸和蘇氨酸位點磷酸化，激活后可以轉位到細胞核內，從而調節靶基因的表達。p38MAPK的激活可誘導多種基因的表達，共同調節炎癥反應，是促進TNF?α產生的重要活化分子[12]。吡啶異咪噠唑化合物SB203580是p38MAPK激酶特異性抑制劑，能競爭性結合到p38α、p38β的ATP結合位點上，抑制其磷酸化，導致p38MAPK失去激酶活性，從而有效抑制p38MAPK信號通路的轉導[13?14]。本實驗結果顯示，煙曲霉刺激后15 min即出現p38MAPK蛋白磷酸化，30 min時p38MAPK磷酸化水平顯著升高。表明煙曲霉刺激人THP?1細胞后可出現p38MAPK蛋白磷酸化。進一步通過p38MAPK信號通路的特異性抑制劑SB203580阻斷信號通路，發現TNF?α mRNA表達水平較未用SB203580組明顯減低。實驗中選擇類似于人體內單核巨噬細胞系的THP?1細胞，可以在體外一定程度上模擬煙曲霉感染人體、侵犯機體固有免疫系統的過程。煙曲霉對人THP?1細胞刺激后可誘導p38MAPK途徑出現活化，TNF?α在mRNA水平、蛋白水平表達量升高，并且在一定程度內呈現劑量依賴性、時間依賴性。表明單核細胞可能參與抗煙曲霉感染固有免疫反應。