從起點到起點：哺乳動物早期胚胎發育研究進展

劉世超 曲永存 張 瑩

（中國科學院動物研究所干細胞與生殖生物學國家重點實驗室 北京 100101）

0 引言

1961年波蘭科學家Tarkowski 在Nature發表了一項開創性的工作，他將不同性別的小鼠8-細胞胚胎通過聚合培養至囊胚期， 并通過體內移植獲得具有雙性別特征的嵌合小鼠［1］。 這項工作標志著哺乳動物現代胚胎研究工作的起始。 在此之后， 經過全世界科學家半個多世紀的不斷探索和發掘， 關于哺乳動物是如何從一個受精卵細胞有組織地發育成為一個完整個體的神秘面紗逐漸開始揭開。在探索過程中衍生出如胚胎干細胞、試管嬰兒等開創性的惠及全人類的重大研究成果。2016年英國科學家Magdalena 成功在體外利用干細胞重構出類似體內狀態的小鼠早期胚胎， 該論文在國際頂級期刊Science上一經發表就引起了巨大的關注， 這標志著哺乳動物早期胚胎發育的研究已經從對胚胎的探索和認知向著操縱和應用轉變， 同時也將哺乳動物胚胎發育的研究推向了一個全新的起點。 2017年Tarkowski 的學生，英國科學家Magdalena 在Science發表了一項令全世界振奮不已的研究成果， 她利用體外培養產生的干細胞，經過人為的重構，獲得了類似于體內狀態的小鼠早期胚胎［2］。雖然未能產生正常出生的小鼠，但這項工作意味著人類對于生命發生的認知已經跨越了受精過程，又向前邁進了一大步。

從嵌合鼠的出生到人為重構小鼠胚胎的產生， 胚胎發育的研究工作已經逐步從探索和認知向著操縱和應用轉變， 同時也將哺乳動物胚胎發育的研究推向了一個全新的起點。 而推動這一領域不斷進步的是理論認知的突破和科學技術的革新，更重要的是，這些理論和技術的進步已經在人類再生醫學、生殖醫療等方面作出了重大貢獻。本文通過介紹哺乳動物胚胎工程和胚胎生物學研究領域的幾個標志性成果， 闡述過去幾十年間哺乳動物胚胎發育學領域的研究進展及其在人類輔助生殖實踐和醫療方面作出的貢獻。

1 哺乳動物早期胚胎發育和基本研究方法概述

哺乳動物胚胎發育起始于受精， 精子通過與卵子質膜的融合將父源的遺傳信息帶入到成熟的卵母細胞中， 在發育生物學中將完成受精的卵母細胞稱為受精卵或合子期胚胎。 該由一個細胞組成的胚胎，就像一個壓縮包，包含著生物體發育所需的所有信息，在合適的母體環境誘導下，它將這些信息有組織地編輯和釋放， 并通過增殖和發育最終形成生物個體。

以小鼠為例， 簡述哺乳動物早期胚胎由一個受精卵到三胚層胚胎的發育過程。 在最早期的7個細胞周期（1～128 細胞）中，細胞只分裂不生長，所以在每次分裂后細胞的大小減半（圖1）。 伴隨著分裂的進行， 小鼠著床前胚胎主要發生2 次重要的形態學改變，在8-細胞期，細胞之間充分接觸失去明顯的界限，這一過程稱為致密化。 在32-細胞早期，一些液體在細胞之間積累，進而在特定位置形成一個液體腔，這時胚胎進入囊胚期。與此同時細胞的空間分布也發生了改變： 在腔的一側聚集了一團細胞，稱為內細胞團；內細胞團和囊胚腔外側有一層上皮化的細胞包裹著， 這層細胞被稱作滋養層細胞。 此時胚胎細胞第1 次發生了可見的組織形態和譜系的分化。

圖1 小鼠著床前胚胎發育時程及形態學變化（改編自參考文獻［11］）

在之后的2 個細胞周期中， 內細胞團細胞繼續進行分化， 其中一部分細胞運動到靠近腔的內表面形成了原始內胚層， 而另一部分覆蓋在原始內胚層下的細胞形成了上胚層。 隨后上胚層細胞經過復雜的遷移和巨大的形態學轉變分化并形成外胚層、中胚層和內胚層。 在隨后的發育中，外胚層主要形成表皮和神經系統； 中胚層主要形成真皮、肌肉、骨骼及其他結締組織和循環系統；內胚層主要形成呼吸道上皮和消化道上皮及由消化道上皮特化而來的各種消化腺。 而之前就已經形成的滋養層和原始內胚層主要參與胎盤的形成。

由于所需環境的特殊性， 直到21 世紀60年代， 早期胚胎發育的研究工作才逐漸擺脫子宮環境的限制，這得益于胚胎體外培養、體外受精、胚胎移植等研究方法的建立。 胚胎體外培養技術是將胚胎從輸卵管或子宮內收集， 置于特定的培養基及培養環境中進行培養， 使胚胎在體外生長發育到一定階段。隨著胚胎培養技術的優化和發展，胚胎體外培養已從單一培養、 共培養發展到今天的序貫培養， 能滿足早期胚胎的快速生長及變化中不同的代謝需求， 胚胎在體外發育的時間也逐漸被延長。盡管如此，到目前為止人工構建的體外培養體系仍然無法支持哺乳動物著床后的正常發育。 2016年來自劍橋大學的Magdalena 成功將人類體外胚胎培養至13 天， 打破了之前9 天的記錄［3］。這項突破能幫助科學家更深入地了解人類胚胎早期發育過程及圍植入期的生理學特征。 體外受精是指哺乳動物的精子和卵細胞在體外人工控制的環境中完成受精過程的技術。 胚胎移植是只將胚胎移植到接收狀態的母體子宮中的技術。 經過多年的研究和發展，體外受精、體外培養和胚胎移植技術已相當完善。 試管嬰兒的出生就是通過將這3 個主要技術相結合而實現的。

2 早期胚胎譜系分化機理的研究及其在胚胎干細胞中的貢獻

如果將合子期的胚胎比喻成包含生物體發育所有信息的壓縮包， 那么其打開方式就是操控生命發生的關鍵。 以小鼠為例，直到8-細胞期所有卵裂球之間在形態學上看不到明顯的差異。 而在接下來的2 個細胞周期后， 這些細胞就發生了巨大的命運分歧，進而形成滋養層與內細胞團。顯然這一分化過程是解壓縮的第1 步結果， 因此關于早期胚胎滋養層和內細胞團分化機理的研究也就成為半個世紀以來該領域的一個核心問題。

卵裂球發生明顯可見的形態學差異起始于桑椹胚期，此時，由于致密化的產生，卵裂球第1 次發生了內、外位置的區分。 同時，外層卵裂球發生極化，導致一些細胞器和蛋白在卵裂球的頂端（靠近胚胎外側）和基底面（靠近胚胎內側）的分布產生差異， 這種差異在接下來16-細胞期至32-細胞期的分裂和發育過程中會進一步導致Hippo 和ROCK 等信號通路在內層和外層細胞間活力的不同［4～6］（圖2、圖3）。 這會進一步導致轉錄共激活因子YAP 在外層細胞中入核，從而激活其下游滋養層關鍵因子如Cdx2 等基因的表達［7］（圖3）。而內層細胞由于沒有發生極化， 其基因表達譜與外層細胞截然不同，很多與多潛能性相關的基因，例如Oct4、Sox2 和Nanog 等維持高表達水平。 而由于沒有YAP 的入核，Cdx2 等滋養層特異性基因在內層細胞不表達。總之，由于極化導致的基因表達差異最終導致了滋養層和內細胞團的分化。值得注意的是，在內細胞團中，多潛能基因的高表達使得其具有了進一步分化和發育成為機體幾乎所有細胞的能力， 在體外這也是胚胎干細胞多潛能性維持的分子基礎。

圖2 小鼠8-細胞期卵裂球極化示意圖（改編自參考文獻［11］）

圖3 極化信號依賴的Hippo 信號通路參與小鼠滋養層與內細胞團分化（改編自參考文獻［10］）

理論研究的進展讓科學家對于哺乳動物早期胚體滋養層與內細胞團分化機理的理解逐漸深入。而在研究過程中，還有一部分學者將關注點放在是否可以將哺乳動物胚胎細胞像其他細胞一樣在體外進行擴增和培養。 最初這一研究的初衷僅僅是對于早期胚胎發育的研究提供一些體外模型，但在之后的研究中其貢獻和意義已遠超于此。1981年Evans 和Kaufman 首次成功分離與小鼠內細胞團相似的胚胎干細胞系；1998年Tanaka S.首次成功分離與小鼠滋養細胞相似的滋養層干細胞系；2007年Tesar P. J.首次成功分離與小鼠上胚層細胞相似的上胚層干細胞系。在研究過程中，學者發現，無論在體外還是體內環境，胚胎干細胞都能被誘導分化為機體幾乎所有的細胞類型。 由于它具有體外培養無限增殖、 自我更新和多向分化的特性， 胚胎干細胞作為供體細胞在克隆和轉基因動物生產中起到了巨大作用。此外，它的出現也極大推動了細胞治療技術的進步。近年來，通過改進胚胎干細胞培養體系， 研究人員已經獲得了類似小鼠2-細胞卵裂球狀態的具有更高發育潛能的胚胎干細胞， 這種細胞不僅可以分化形成機體的所有細胞類型， 還可以分化并貢獻到未來形成胎盤的滋養層細胞中。 事實上這些體外培養體系改善的思路， 都參考于同時期體內胚胎細胞所處的分子環境。 雖然干細胞研究領域已經逐漸與發育生物學領域分離，并向著應用方向發展，但在理論上它的產生離不開發育生物學的研究成果，未來其在異種嵌合、 器官再造等方向的應用也離不開哺乳動物早期胚胎發育研究的支持。

3 早期胚胎卵裂球的可塑性與著床前遺傳學診斷技術

如果說胚胎干細胞的故事起始于內細胞團，譜系分化的故事則可以追溯到胚胎伊始。 盡管明顯可見的分化行為產生于8-細胞期至16-細胞期，但在此之前，早期胚胎卵裂球之間是否存在不可見的、 但可以導致命運分化的差異仍然是學者研究和爭論的重點。

人為破壞小鼠2-細胞期胚胎一個卵裂球，在部分胚胎中，剩余的一個卵裂球也可以發育，直至產生出生的胎兒。 同樣，在4-細胞期和8-細胞期也具有類似的現象。 這種卵裂球可以適應外界實驗干擾并發育形成胎兒的現象稱為卵裂球的可塑性，在胚胎水平上稱為調整型發育。調整型發育是哺乳動物早期胚胎發育所特有的， 在低等動物胚胎發育過程中， 人為破壞某些卵裂球會導致后代致死或某些特定的組織器官發育缺陷， 這種卵裂球之間的不可替代性稱為鑲嵌式發育。 也正因如此， 很多學者認為哺乳動物早期胚胎卵裂球之間在命運傾向上不存在差異。

然而也有研究表明，在8-細胞期以前，雖然看不到明顯的形態學差異， 但是卵裂球中一些蛋白、RNA 或細胞器等的分布和積累已經產生差異，這種差異被稱為卵裂球的異質性。 例如，瘦素和STAT3 在胞質中的分布、組蛋白精氨酸甲基化水平及轉錄因子SOX2 在細胞核和胞質中的穿梭等，這些因子在4-細胞期4 個卵裂球中的表達量或行為的不同， 會導致這4 個卵裂球后代在囊胚期貢獻到滋養層或內細胞團的能力不同。此外，將2-細胞期2 個卵裂球分離后體外培養至囊胚期再移植回體內，結果表明不是所有的2-細胞期單個卵裂球都可以支持發育并產生胎兒， 進一步研究表明2-細胞單個卵裂球發育潛力的差異是由于其在囊胚期產生NANOG 陽性的多潛能細胞個數不同。 在著床前， 只有包含4 個或者4 個以上NANOG 陽性多潛能細胞的囊胚才能發育產生胎兒。與此類似，通過回溯成人體細胞突變至胚胎發育期，研究者發現2-細胞期某一個卵裂球在個體血細胞中的貢獻率達到70%， 而另一個只有30%［8］。這些結果說明，早在2-細胞期卵裂球之間就存在可以導致其命運貢獻能力不同的異質性。

盡管到目前為止還沒有一個完善理論可以解釋哺乳動物卵裂球的異質性與可塑性如何共同行使作用調節早期胚胎發育， 關于卵裂球可塑性和異質性的研究已經在輔助生殖領域起到了關鍵作用。 有報道表明不育癥夫婦借助試管嬰兒技術產生的胚胎， 由于父母本身及體外操作等原因導致遺傳異常的發生機率明顯增加。 因此對遺傳異常篩查的著床前遺傳學診斷非常必要， 具體的做法是在胚胎發育的4-細胞期或8-細胞期取出1～2個卵裂球進行遺傳學分析。 而這一方法可行的基礎就來自于對于卵裂球可塑性研究的結果， 即從4-細胞胚胎中去除1 個卵裂球或者從8-細胞期胚胎中去除1～2 個卵裂球不影響胚胎發育及胎兒的產生。 目前著床前遺傳學診斷技術已在世界廣泛應用， 并已在避免試管嬰兒遺傳疾病方面作出了巨大貢獻。

4 嵌合發育與異種嵌合技術

盡管以小鼠為模型的研究工作為哺乳動物早期胚胎發育機理奠定了扎實的基礎， 但事實上哺乳動物不同物種間早期胚胎在發育時程、 胚胎運動和組織方式上都存在著巨大的差異。 哺乳動物不同物種或者僅僅是相同物種不同基因型的胚胎發育兼容性有多大， 胚胎的自我調整能力到底有多強，一直以來都是發育生物學的重要研究問題。基于對這些問題的關注， 發育生物學領域首先在哺乳動物發育過程中提出了嵌合發育， 并通過體外胚胎操作技術首次實現黑白花色和雙性別特征嵌合小鼠的生產。

嵌合體指的是不同遺傳背景或者性狀混雜表現的個體。在發育生物學領域指的是由不同遺傳背景的細胞組成的生物性狀混雜嵌合的個體。如前文所述，種內不同個體早期胚胎細胞聚合可以產生嵌合體，這說明相同物種不同基因型的胚胎發育具有兼容性。 此外，大鼠和小鼠2 個不同屬的物種之間也實現了嵌合發育， 并產生了胰臟補償的嵌合個體。 但是由于理論認知和技術支持的不足，目前絕大多數物種間無法實現嵌合發育，也不能產生嵌合個體。這說明，至少在目前的研究水平上，大多數哺乳動物不同物種間早期胚胎發育不具有兼容性。而在發育過程中，不同遺傳背景的細胞如何相互合作和競爭最終貢獻到嵌合個體中目前也不清楚。

與理論研究進展不同的是， 在應用領域嵌合技術在飛速發展并得到了廣泛的關注。 1968年Gardner R. L.建立了囊胚腔內注射的嵌合方法，并且生產出嵌合小鼠。 Evans 和Martin 等應用這一方法， 將胚胎干細胞注射到小鼠囊胚腔中生產出嵌合小鼠。從此，以胚胎干細胞為工具通過囊胚注射的方法生產轉基因小鼠逐漸成為轉基因動物生產最主要的方式。2006年日本科學家山中伸彌成功將體細胞誘導產生誘導多能干細胞（iPS 細胞），并以此研究成果獲得了2012年諾貝爾生理學或醫學獎。異種嵌合與iPS 技術的結合為異種器官再造點燃了希望。 將器官病變患者的皮膚細胞在體外誘導成為iPS 細胞，進一步將這些細胞注射到器官敲除豬的囊胚中， 就有可能利用豬生產出完全來源于患者細胞的器官。 2017年初美國科學家Belmonte 在世界頂級雜志Cell發表了利用多潛能干細胞實現了人豬異種嵌合胚胎的生產， 并且獲得了體內發育3～4 周的嵌合胎兒［9］。這項研究再次點燃了嵌合體的研究工作， 相信不久的未來在發育生物學領域關于嵌合發育的研究工作將會產生更多的成果以支持其在再生醫學領域的應用。

5 總結和展望

回顧半個多世紀以來早期胚胎發育的研究工作成績卓越； 在理論上極大地擴展了人們對于哺乳動物生命由來的認知， 在實際應用上直接促進了干細胞治療技術和輔助生殖技術的產生。今天，站在新的起點上， 哺乳動物早期胚胎發育研究工作仍然面臨著巨大的挑戰； 在理論上如何將調整型發育與鑲嵌型發育統一， 尋找到生命解壓縮的真正路徑？在實際應用上能否跨越受精過程，在體外人工構建具有發育能力的胚胎？可以預見，在未來， 早期胚胎發育研究領域的突破將會直接促進器官再造、 太空胚胎和體外妊娠等惠及全人類生育和健康的重要科學技術的實現。