懷山藥酵素粉的制備及抗氧化作用

費 鵬 楊同香 趙勝娟 徐云鳳 陳俊亮 李芳梅 康懷彬

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

懷山藥又被稱為山藥、白山藥，肉質細嫩、營養豐富、富含必需氨基酸及鉀、鎂、鈣、鐵、鋅、VC、VA、視黃醇、胡蘿卜素等多種微量元素[1-2]。經常食用懷山藥可以預防脂肪堆積、降低膽固醇、增強免疫功能、提高記憶力、消除神經疲勞、調節神經失調、調節更年期癥狀[3-4]。隨著人們對懷山藥營養價值和保健功能的認可，如何提高懷山藥產品的多樣性，充分開發其保健功能成為了目前需要解決的問題。

植物酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果、谷豆、海藻、藥食兩用本草等食材為原料，加(或不加)糖類物質，經過較長時間發酵而得到的功能性發酵產品[5-6]。經過長時間的發酵，酵素會產生多種有益于人體健康的生物活性物質，如酚類、黃酮類、有機酸類、多糖類以及酶類等，這些生物活性物質能夠清除機體內多余的自由基，減輕它們對機體的損傷，從而改善人體機能[7-9]。Sulasiyah等[10]利用米曲霉發酵姜黃，并通過清除自由基能力的評估、總酚的測定和植物性化學物質的篩選評價其抗氧化能力，結果發現姜黃酵素的抗氧化活性隨著發酵時間的延長而顯著增加。Oladeji等[11]發現玉米胚乳酵素中總類胡蘿卜素和VC的含量顯著增加，提高了其對自由基、二銨鹽和脂質過氧化物的清除能力。Jgf等[12]制備了葡萄皮酵素，并發現經過發酵的葡萄皮中總酚的含量顯著增加，抗氧化能力顯著提高，從而有助于內皮依賴性血管擴張。此外，西蘭花[13]、海棠果[14]、麥苗[15]、納豆[16]、藍靛果椰子復合酵素[17]等植物酵素的制備及抗氧化的研究也已被報道。

目前，懷山藥的酵素產品尚未見報道，本研究擬以懷山藥為原料，利用植物乳桿菌發酵懷山藥原液以發掘懷山藥的益生功能，以懷山藥酵素的抗氧化能力為指標，優化植物乳桿菌發酵懷山藥的工藝參數，利用噴霧干燥技術制得懷山藥酵素粉，并對懷山藥酵素粉清除超氧陰離子和羥自由基的能力進行評估。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

懷山藥：洛陽丹尼斯超市；

植物乳桿菌(LaobacillusplantarumKLDS-511)：東北農業大學食品學院菌種庫；

茚三酮、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、苯酚、鄰二氮菲、VC等：分析純，北京奧博星生物技術有限責任公司；

30%雙氧水溶液：陜西三橋精細化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子分析天平：HZK-FA210S型，上海精學科學儀器有限公司；

噴霧干燥機：SP-1500型，江蘇互幫干燥設備有限公司；

紫外/可見分光光度計：UV-1100型，深圳市信之邦儀器設備有限公司；

電熱恒溫隔水式培養箱：BG-160型，上海知楚儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 懷山藥酵素粉的制備流程

(1) 懷山藥預處理：清洗、去皮，切片，護色，加水打漿，糊化，過濾，冷卻，備用

(2) 懷山藥酵素的制備：懷山藥汁，調配(加糖)，均質，殺菌，冷卻接種，發酵(恒溫箱發酵)，恒溫加熱(25 ℃)，檢測(測各條件下吸光度值，計算出SOD活性值)，噴霧干燥，成品

1.2.2 超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)活力的測定 取發酵好的懷山藥酵素液5 mL置于燒杯中，加入3 mL、0.05 moL/L的磷酸緩沖液，在25 ℃下離心20 min，取上清液。采用鄰苯三酚自氧化法[18]測定樣品SOD酶活力。

1.2.3 單因素試驗

(1) 糖濃度：在接種量4%、發酵時間24 h、發酵溫度42 ℃ 下，分析糖濃度(6%，8%，10%，12%，14%)對懷山藥發酵液SOD活性的影響。

(2) 接種量：在糖濃度10%、發酵時間24 h、發酵溫度42 ℃ 下，分析接種量(3%，4%，5%，6%，7%)對懷山藥發酵液SOD活性的影響。

(3) 發酵時間：在糖濃度10%、接種量4%、發酵溫度42 ℃ 下，分析發酵時間(12，18，24，30，36 h)對懷山藥發酵液SOD活性的影響。

(4) 發酵溫度：在糖濃度10%、接種量4%、發酵時間24 h 下，分析發酵溫度(36，38，40，42，44 ℃) 對懷山藥發酵液SOD活性的影響。

1.2.4 正交試驗 根據單因素試驗的結果，進一步用L9(34)正交試驗方案進行優化。以懷山藥發酵液SOD活性值為指標，確定糖濃度、接種量、發酵時間、發酵溫度的最優參數組合。

1.2.5 噴霧干燥 以最優參數條件下得到的懷山藥酵素液為原料，利用噴霧干燥法制備懷山藥酵素粉，進料量分別設置為300，350，400 mL/h，進料溫度設置為140 ℃，最終得到顆粒度均勻的產品。將制得的懷山藥酵素粉加水復原到原來的體積，測定其SOD活性，比較噴霧干燥前后酵素液SOD活性的變化。

1.2.6 懷山藥酵素粉對超氧陰離子清除能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[19]。以相同濃度的VC作為對照組，測定不同濃度懷山藥酵素粉處理后的樣品在320 nm波長下的吸光值，按式(1)計算懷山藥酵素粉對超氧陰離子的清除率。

(1)

式中：

c1——超氧陰離子清除率，%；

A0——空白對照；

An——不同濃度懷山藥酵素粉處理后的樣品吸光度。

1.2.7 懷山藥酵素粉對羥自由基清除能力的測定 采用H2O2/Fe體系反應法[20]。以等濃度的VC作為對照組，測定不同濃度懷山藥酵素粉反應系統在536 nm下的吸光值，并按式(2)計算懷山藥酵素粉對羥基自由基的清除率。

(2)

式中：

c2——羥基自由基清除率，%；

A0——空白對照；

A1——只添加H2O2的吸光度；

A2——只添加懷山藥酵素粉的吸光度；

A3——添加懷山藥酵素粉和H2O2的吸光度。

1.2.8 數據分析 試驗數據利用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，選擇 Tukey’s 檢驗，當 P<0.05 時差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 糖濃度對懷山藥酵素液SOD活性的影響 由圖1可知，懷山藥酵素液SOD活性隨著糖濃度的增加先升高再降低，糖濃度為12%時SOD活性最高；當糖濃度大于12%，SOD活性開始下降，這是因為高濃度的糖會造成懷山藥液體系滲透壓升高，不利于植物乳桿菌的發酵，因此，糖濃度為12%最佳。

圖1 糖濃度對懷山藥酵素液SOD活性的影響

圖1 Effect of sugar concentration on SOD activity of Chinese yam ferment liquid

2.1.2 接種量對懷山藥酵素液SOD活性的影響 由圖2可知，懷山藥酵素液SOD活性隨著植物乳桿菌接種量的增加而增加，當接種量達到5%后SOD活性趨于穩定，可能是懷山藥混合液中的碳源在5%發酵劑的作用下已經被全部消耗，在這種情況下，即便增加發酵劑SOD的活性也不會提高，因此，接種量為5%最佳。

圖2 接種量對懷山藥酵素液SOD活性的影響

圖2 Effect of inoculum concentration on SOD activity of Chinese yam ferment liquid

2.1.3 發酵時間對懷山藥酵素液SOD活性的影響 由圖3可知，懷山藥酵素液SOD活性隨著發酵時間的延長而增加，當發酵時間大于30 h時SOD活性不再繼續增加，說明懷山藥酵素液已經發酵完成。因此，發酵時間為30 h最佳。

2.1.4 發酵溫度對懷山藥酵素液SOD活性的影響 由圖4可知，懷山藥酵素液SOD活性隨著發酵溫度的上升先增加后減少，當發酵溫度為42 ℃時SOD活性最高。因此，發酵溫度為42 ℃最佳。

圖3 發酵時間對懷山藥酵素液SOD活性的影響

圖3 Effect of fermentation time on SOD activity of Chinese yam ferment liquid

圖4 發酵溫度對懷山藥酵素液SOD活性的影響

圖4 Effect of fermentation temperature on SOD activity of Chinese yam ferment liquid

2.2 正交試驗

利用L9(34)正交試驗因素優化懷山藥酵素的發酵條件，正交試驗因素與水平如表1所示，試驗結果如表2、3所示。

表1 正交試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗結果表Table 2 The orthogonal test results table

表3 正交試驗方差分析表?Table 3 Orthogonal test analysis of variance

? ** 表示因素對試驗結果具有極顯著的影響(P<0.01)。

由表2可知，4個因素對懷山藥酵素液SOD活性的的影響順序為：接種量>發酵時間>發酵溫度>糖濃度。懷山藥酵素液的最佳因素水平組合為糖濃度12%、接種量6%、發酵時間30 h、發酵溫度42 ℃。由表3可知，接種量、發酵時間、發酵溫度對懷山藥酵素液SOD活性的影響極顯著(P<0.01)。

2.3 驗證實驗

按照最佳因素水平A2B3C2D2進行3次懷山藥酵素液制備實驗，懷山藥酵素液的SOD活性分別為15.38，15.32，15.35 U/mL，3次實驗的平均值為15.35 U/mL，高于正交試驗各組SOD活性，驗證實驗的變異系數(coefficientofvari-ation，CV)為0.20%，說明該最佳工藝穩定可行。

2.4 噴霧干燥前后SOD活性的比較

利用噴霧干燥將懷山藥酵素液制備成粉，并比較懷山藥酵素原液和同濃度下懷山藥酵素粉復原液SOD活性，結果見圖5。與懷山藥酵素原液(SOD活性為15.35 U/mL)相比，懷山藥酵素粉SOD活性(SOD活性為14.73 U/mL)稍有下降，但不顯著(P>0.05)。說明雖然懷山藥酵素原液在噴霧干燥中會受到高溫的破壞，但是由于時間較短，懷山藥酵素原液中的活性物質并沒有被顯著破壞，因此可以利用噴霧干燥制備懷山藥酵素粉。

圖5 酵素原液和復原酵素液中的SOD活性比較

圖5 Comparison of SOD activity between ferment liquid and recovery ferment liquid

2.5 懷山藥酵素粉對超氧陰離子的清除能力

對超氧陰離子的清除能力是衡量懷山藥酵素粉抗氧化能力的重要指標之一，如圖6所示，懷山藥酵素粉對超氧陰離子的清除能力與其濃度呈正比，0.35 mg/mL的懷山藥酵素粉能夠清除83.56%的超氧陰離子，稍低于VC的清除能力，說明懷山藥酵素粉具有較強的清除超氧陰離子的能力。

圖6 懷山藥酵素粉對超氧陰離子的清除率

圖6 Superoxide anion scavenging rate of Chinese yam ferment powder

2.6 懷山藥酵素粉對羥自由基的清除能力

羥自由基清除率是評估懷山藥酵素粉抗氧化能力的另一個重要指標，如圖7所示，懷山藥酵素粉的羥自由基清除能力略低于VC對照組，且隨著酵素濃度的增加而提高。當懷山藥酵素粉的質量濃度達到0.6 mg/mL時，羥自由基的清除率達到90.88%，說明懷山藥酵素粉具有較強的羥自由基清除能力。

圖7 懷山藥酵素粉對羥自由基的清除率

圖7 Hydroxyl free radical scavenging rate of Chinese yam ferment powder

3 結論

本研究優化了懷山藥酵素粉制備的工藝參數。結果表明，影響懷山藥酵素粉SOD活性的順序為：接種量>發酵時間>發酵溫度>糖濃度，最佳發酵工藝為糖濃度12%、接種量6%、發酵時間30 h、發酵溫度42 ℃。此條件下懷山藥酵素液SOD活性為15.35 U/mL，且經過噴霧干燥制備成懷山藥酵素粉后其SOD活性沒有顯著變化。此外，抗氧化活性試驗顯示0.35 mg/mL的懷山藥酵素粉復原液能夠清除83.56% 的超氧陰離子，0.6 mg/mL懷山藥酵素粉復原液能夠清除90.88%的羥自由基，可見本試驗制備的懷山藥酵素粉具有良好的抗氧化能力。

本試驗中制備懷山藥酵素粉采用了噴霧干燥的方法，雖然通過分析能夠發現噴霧干燥并沒有顯著地影響懷山藥酵素的抗氧化性，但一定程度上降低了產品SOD的活性，因此在后續的研究中將采用真空冷凍干燥技術制備懷山藥酵素粉，盡可能地保護產品中的功能成分。此外，本研究只對懷山藥酵素粉的抗氧化活性進行了評估，并沒有對該產品的具體生理功能進行探究。理論上抗氧化活性是生物活性成分發揮益生功能的理論基礎，因此在接下來的研究中會針對性地挖掘懷山藥酵素粉的生理功能。