低鹽白鰱魚糜凝膠超高壓制備工藝優化及凝膠特性

戴慧敏葉 韜林 琳姜紹通陸劍鋒

(1. 合肥工業大學食品科學與工程學院，安徽 合肥 230009；2. 淮南師范學院生物工程學院，安徽 淮南 232038)

白鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)營養豐富，是中國產量最高的大型淡水魚種之一。但白鰱魚肉薄刺多，土霉味、魚腥味重，對其進行深加工，制作成冷凍魚糜制品，可以提高產品附加值[1]。在魚糜制品加工過程中，通常在斬拌工序中添加2～3 g/100 g·魚糜的食鹽(NaCl)來溶解肌原纖維蛋白，誘導蛋白質的展開，便于后續加熱工藝能夠形成熱凝膠[2-3]；然而由于過量攝入食鹽可能會引起高血壓、骨質疏松、胃消化系統紊亂等多種疾病，因此開發低鹽產品是魚糜制品研發的一個重要方向。但是低鹽條件下魚糜蛋白質斬拌時不能夠充分溶解展開，而導致低鹽魚糜凝膠強度低、持水性差、口感粗糙[4]6。因此提高低鹽魚糜凝膠的凝膠強度和持水性亟需解決。

凝膠強度、持水性是衡量魚糜制品特性的重要指標，但目前的熱加工方式(如傳統水浴加熱，又稱“二段式加熱”)對于改善魚糜凝膠特性還不夠理想[5]，尤其在改善低鹽魚糜凝膠特性方面。因此有研究將微波技術應用到低鹽魚糜中，如付湘晉等[6]發現采用微波加熱的方法可以顯著提高低鹽白鰱魚糜(1%)凝膠強度和持水性，然而微波加熱選擇性高，魚糜內部升溫不均勻，影響凝膠品質[7]。超高壓作為一種新型技術，通過誘導魚糜蛋白變性，破壞原有空間結構，構造新的凝膠網絡結構，可以得到凝膠特性更好的魚糜制品[8]。Cando等[9]的研究表明，超高壓(300 MPa)應用低鹽阿拉斯加鱈魚魚糜凝膠可以誘導肌原纖維蛋白展開，使得理化性質和感官特性優于普通食鹽添加量(3%)魚糜凝膠。同時，超高壓對魚糜凝膠特性的影響與壓力、保壓時間、溫度、魚糜種類等有密切關系，程珍珠等[10]研究發現400 MPa處理30 min時，馬鮫魚糜的硬度和咀嚼度分別提高了2.87和2.70倍；500 MPa處理30 min時，兩者均有所下降。目前已有研究[11-12]采用超高壓技術改善低鹽海水魚糜制品品質，但是在低鹽淡水魚糜制品中的應用較少，尤其是應用超高壓技術制備低鹽白鰱魚糜還尚未見報道。

在前期制備低鹽魚糜的預試驗中，得出添加1.5% NaCl可以保證白鰱魚糜制品所屬的咸味味感，但凝膠品質明顯低于工業化生產中的白鰱魚糜(含NaCl量為2.5%左右)。因此，本試驗通過響應面法優化出超高壓制備低鹽魚糜凝膠工藝參數，并對其凝膠特性進行分析，以期為改善低鹽魚糜凝膠品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活白鰱魚：重量(1.0±0.2) kg，體長(36.0±3.0) cm，市售；

塑料腸衣：食品級，規格為45～47 mm(折疊直徑)灌腸后直徑約30 mm，市售；

氯化鈉：食品級，市售；

乙醇、25% 戊二醛、溴化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)：分析純，美豐生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

斬拌機：S2-5型，廣州旭眾食品機械有限公司；

超高壓：HPP. L2-600/0.6型，天津華泰森淼生物工程技術股份有限公司；

質構儀：TA-XT plus型，英國Stable Micro System公司；

臺式高速冷凍離心機：CT15RT型，上海天美生化儀器工程有限公司；

電泳儀：DYY-11型，北京市六一儀器廠；

掃描電子顯微鏡：JSM-6490LV型，日本電子株式會社。

1.3 白鰱魚糜凝膠的制備方法

1.3.1 魚糜凝膠的制備

白鰱魚糜解凍(4 ℃條件下)→斬拌(空斬3 min，添加1.5% NaCl或2.5% NaCl斬8 min)→灌腸→加熱(二段式加熱，先35 ℃加熱1 h，再90 ℃加熱0.5 h)→冷卻(冰水冷卻)→4 ℃條件下放置過夜→得到常壓低鹽魚糜和常壓普通魚糜

1.3.2 低鹽魚糜的超高壓處理 將灌腸之后的低鹽魚糜真空包裝后，放入超高壓設備，設置好已定的參數，進行升壓、保壓、卸壓，之后取出樣品，再進行二段式加熱處理，得到高壓低鹽魚糜凝膠。

1.4 超高壓低鹽魚糜的單因素試驗

魚糜凝膠中添加1.5% NaCl，壓力分別為100，200，300，400，500 MPa，保壓時間為10 min，根據凝膠強度和持水性確定壓力；魚糜凝膠中添加1.5% NaCl，壓力為300 MPa，保壓時間分別為5，10，15，20，25 min，根據凝膠強度和持水性確定保壓時間；魚糜凝膠中添加1.5% NaCl，壓力為300 MPa，保壓時間為10 min，溫度分別為10，20，30，40，50 ℃，根據凝膠強度和持水性確定溫度。

1.5 超高壓低鹽魚糜的響應面優化

從單因素試驗中選取壓力、保壓時間以及溫度的最佳范圍，并以凝膠強度和持水性為響應值進行響應面優化。

1.6 魚糜凝膠強度的測定

參照文獻[13]。

1.7 持水性測定

參照文獻[14]。

1.8 魚糜凝膠品質的比較

從質構(TPA)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠以及微觀結構等方面，將響應面優化后的超高壓低鹽魚糜(1.5% NaCl)與常壓低鹽對照組(1.5% NaCl)和常壓普通添加鹽量對照組(2.5% NaCl)凝膠品質進行比較，分析超高壓低鹽魚糜的品質特性。

1.8.1 TPA的測定 將魚腸切成圓柱體(直徑20 mm，高10 mm)。選用質構儀的 TPA(Texture Profile Analysis)模型分析低鹽白鰱魚糜凝膠的質構。測定參數設定為：探頭類型為P/36R，觸發類型Button、測試前速率1.00 mm/s、探頭返回速率1.00 mm/s、下壓距離4.00 mm，2次壓縮之間的停留時間為5 s，重復檢測6次。

1.8.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 稱取魚糜凝膠3 g，根據Kudre等[15]的方法進行電泳分析。

1.8.3 掃描電鏡(SEM)觀察凝膠結構變化 參照文獻[4]16。

1.9 數據處理

所有數據均采用Excel 2003軟件和SSPS 19.0進行作圖和顯著性統計分析。

2 結果與分析

2.1 超高壓制備低鹽魚糜的單因素試驗

2.1.1 壓力對低鹽白鰱魚糜凝膠強度和持水性的影響 魚糜凝膠強度是指凝膠破壞時單位面積所受的力，被作為評價魚糜凝膠的堅實程度的指標[16]，凝膠強度大小可反映魚糜凝膠性能好壞。由圖1(a)可知，魚糜凝膠強度隨著壓力增大，呈先增加后減少趨勢，并在300 MPa達到最大值(P<0.05)。超高壓處理使低鹽白鰱魚糜凝膠強度增大，可能是超高壓處理促使蛋白質變性，使蛋白質網絡結構更加致密，凝膠性能得到改善[17]。羅小玲等[18]研究表明高壓對馬鮫魚凝膠性能在400 MPa達到最大，此后隨著壓力增加會破壞凝膠空間網絡結構致使凝膠強度下降，降低魚糜凝膠品質。

魚糜凝膠持水性能力是指魚糜在離心過程中將水分保持在其微觀結構中的能力，是魚糜凝膠特性的重要指標之一[19]。從圖1(b)可以看出，壓力在200～500 MPa時持水性在較好狀態，有先增大后減少的趨勢，說明超高壓處理可以提高低鹽魚糜凝膠的持水性(P<0.05)，且在300 MPa達到最大值，與400 MPa沒有顯著性變化，可能是超高壓處理促使蛋白質發生解聚，溶解性升高，使更多自由水與蛋白質形成結合水，增強持水性[20]。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖1 壓力對低鹽白鰱魚糜凝膠強度和持水性的影響Figure 1 Effect of pressure on the gel strength and WHC of low-salt silver carp surimi gels

2.1.2 保壓時間對低鹽白鰱魚糜凝膠強度和持水性的影響

從圖2(a)可以看出，保壓時間對低鹽白鰱魚糜凝膠強度的影響也是呈先增大后減少的趨勢，在保壓10 min(300 MPa)時得到凝膠強度最大(P<0.05)；疏水鍵相互作用和二硫鍵之間的相互作用可以改善魚糜凝膠強度[21]，保壓10 min后，繼續延長保壓時間，魚糜凝膠強度變化不明顯(P>0.05)，而在保壓時間達到20 min時的凝膠強度開始顯著降低(P<0.05)。在胡飛華[22]32的研究中也得出類似結果，加壓時間過長可能導致蛋白子分子內部化學鍵斷裂，組織蛋白酶水解魚糜中的大量蛋白質，且占主導作用，使得凝膠網絡結構交聯度降低，魚糜凝膠強度下降[23]，因此加壓時間過長不能改善魚糜凝膠性能。

從圖2(b)可以看出，保壓時間對持水性的影響也是呈先增大然后減少的趨勢，最大值在10 min(300 MPa)時得到(P<0.05)，但與保壓時間15，20 min時均沒有顯著性差異，在保壓時間為25 min時，魚糜凝膠的持水性能顯著降低(P<0.05)，可能是保壓時間過長破壞蛋白質分子內部化學鍵，魚糜凝膠網絡交聯度降低，致使水分流出，降低持水性。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖2 保壓時間對低鹽白鰱魚糜凝膠強度和持水性的影響

圖2 Effect of holding time on the gel strength and WHC of low-salt silver carp surimi gels

2.1.3 超高壓處理溫度對低鹽白鰱魚糜凝膠強度和持水性的影響 從圖3(a)可看出，超高壓處理溫度對低鹽白鰱魚糜凝膠強度影響顯著。超高壓處理溫度升高不利于凝膠強度改善，隨著溫度升高，凝膠強度呈下降趨勢，從30 ℃開始出現顯著下降(P<0.05)，可能是低溫度的超高壓處理使得蛋白容易形成凝膠，魚糜凝膠劣化溫度帶在40～50 ℃，內源性組織蛋白酶類能引起肌球蛋白分解，蛋白質凝膠網絡結構容易被破壞，而導致凝膠特性急劇下降[22]33。因此超高壓處理溫度并不是越高越好，適宜的超高壓處理溫度可以得到較好的凝膠強度。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖3 溫度對低鹽白鰱魚糜凝膠強度和持水性的影響

圖3 Effect of temperature on the gel strength and WHC of low-salt silver carp surimi gels

同樣超高壓處理溫度過高也不利于魚糜凝膠的持水能力。從圖3(b)可以看出，隨著溫度升高，低鹽白鰱魚糜凝膠的持水性呈現減弱的趨勢，30 ℃以后持水性顯著下降，溫度越高下降越快，可能是適宜的溫度使蛋白質凝膠網絡更致密，能捕捉住更多的水分，從而使持水性增大[24]，但是溫度過高會導致蛋白質凝膠網絡結構容易被破壞，水分流失以至于持水性能變差。

2.2 響應面優化超高壓對低鹽白鰱魚糜最佳工藝的確定

2.2.1 回歸模型的建立 在單因素試驗結果的基礎上，以凝膠強度和持水性為指標，采用三因素三水平進行Box-Benhnken試驗設計和分析，試驗因素水平見表1，試驗設計及結果見表2。

2.2.2 凝膠強度回歸模型的顯著性檢驗和方差分析 采用Design-Expert 7.0軟件對試驗結果回歸擬合，得到凝膠強度對壓力、保壓時間、處理溫度的二次多元回歸方程為：

表1 Box-Benhnken試驗因素水平表Table 1 Factor and levels of Box-Benhnken

表2 試驗設計及結果Table 2 Design and results of experiment

R1=254.03+8.91A+6.54B+11.35C+8.02AB-1.02AC-5.78BC-51.56A2-22.26B2-10.84C2。

(2)

凝膠強度的顯著性檢驗和方差分析見表3，可以看出試驗模型極顯著(P<0.01)，失擬不顯著(P>0.05)，表明該回歸模型可用?；貧w模型的決定系數R2為0.990 4、變異系數C.V.為2.28%<10%，分別表明此二次多項式的回歸效果好且回歸模型具有試驗穩定性。從表3還可以看出，一次項A、B、C，交互項AB、BC以及二次項A2、B2、C2對低鹽魚糜凝膠強度都有顯著性影響(P<0.05)。

各因素的交互作用對低鹽魚糜凝膠強度的影響見圖4。由圖4可知，壓力、保壓時間和處理溫度兩兩交互作用對魚糜凝膠強度影響比較明顯。當其他因素恒定，在一定范圍內，隨著超高壓壓力的提高和保壓時間的延長以及處理溫度的增大，魚糜凝膠強度都呈現不同變化。其中，由于壓力和溫度二者曲線彎曲程度較大，可知壓力和溫度對凝膠強度影響較大，保壓時間影響較小。

表3 凝膠強度的顯著性檢驗和方差分析?Table 3 Significance and analysis of variance (ANOVA) of gel strength

? *差異顯著，P<0.05；**差異極顯著，P<0.01；R2為0.990 4；C.V.為2.28%。

2.2.3 持水性回歸模型的顯著性檢驗和方差分析 采用Design-Expert 7.0軟件對試驗結果回歸擬合，可以得到持水性對壓力、保壓時間、處理溫度的二次多元回歸方程為：

R2=72.52+0.15A+0.88B+0.61C-1.16AB-0.025AC-0.033BC-1.5A2-2.32B2-0.21C2。

(3)

持水性的顯著性檢驗和方差分析見表4，由表4可以看出試驗模型極顯著(P<0.01)，失擬不顯著(P>0.05)?；貧w模型的決定系數R2=0.974 5，變異系數C.V.=0.61%<10%，可以得出此二次多項式的回歸效果好且該回歸模型具備試驗穩定性。從表4還可以看出，一次項B、C交互項，AB以及二次項A2、B2對低鹽白鰱魚糜持水性都有顯著性影響(P<0.05)。

圖4 壓力、保壓時間和溫度的交互作用對低鹽魚糜凝膠強度的影響Figure 4 Effects of pressure, holding time and temperature interaction on gel strength of low-salt surimi gels表4 持水性的顯著性檢驗和方差分析?

方差來源自由度平方和均方F值P值顯著性模型949.225.4729.74<0.000 1**A10.180.180.980.355 4B16.146.1433.410.000 7**C13.013.0116.390.004 9**AB15.385.3829.270.001 0**AC12.50E-032.50E-03 0.014 0.910 4BC14.23E-034.23E-030.0230.883 8A219.489.4851.58 0.000 2**B2122.6322.63123.07<0.000 1**C210.180.180.990.352 2殘差71.290.18失擬30.280.0940.370.777 8純誤差41.010.25總和1650.51

? *差異顯著，P<0.05；**差異極顯著，P<0.01；R2為0.974 5；C.V.為0.61%。

圖5所示是各因素的交互作用對低鹽魚糜凝膠持水性的影響。由圖5可知，壓力、保壓時間和處理溫度及交互作用對低鹽白鰱魚糜凝膠持水性影響比較明顯。當其他因素恒定，在一定范圍內，隨著超高壓壓力的提高和保壓時間以及溫度的增加，魚糜凝膠持水性有一定變化，且由于壓力和保壓時間二者曲線彎曲程度較大，可知壓力和保壓時間對持水性影響較大，溫度影響較小。

2.2.4 最佳工藝的確定 通過Design-Expert軟件計算分析得到最大凝膠強度和持水性時的最佳工藝條件是：壓力306.22 MPa，保壓時間10.64 min，溫度26.95 ℃，由此預測出凝膠強度最大值為257.01 g·cm，持水性最大值為72.92%。考慮到實際操作和實驗可行性，以壓力300 MPa，保壓時間10 min，溫度25 ℃為條件進行驗證性實驗，此時凝膠強度為258.24 g·cm，持水性為71.92%。

2.3 超高壓低鹽魚糜凝膠品質比較

2.3.1 凝膠特性的分析 由表5可知，優化后的超高壓低鹽魚糜凝膠強度(258.24 g·cm)與最佳工藝理論值接近。幾種魚糜凝膠品質比較發現，在常壓下(0.1 MPa)，添加1.5% NaCl的低鹽魚糜凝膠的凝膠強度、持水性均顯著低于添加2.5% NaCl的普通魚糜的(P<0.05)，因此，食鹽添加量是影響白鰱魚糜凝膠強度的重要因素。但經過超高壓處理的低鹽魚糜凝膠的凝膠強度、持水性均顯著(P<0.05)大于常壓處理組的(2.5% NaCl和1.5% NaCl)，可能是高壓可促進蛋白質分子內部交聯，從而改善魚糜凝膠網絡結構，增強凝膠強度、持水性能，進而改善魚糜凝膠特性[13]。TPA質構參數指標方面，在常壓下(0.1 MPa)，添加1.5% NaCl的低鹽魚糜凝膠的黏附性、咀嚼度同樣均顯著低于添加2.5% NaCl的常壓魚糜的(P<0.05)；而超高壓處理的低鹽魚糜凝膠的硬度、咀嚼度顯著(P<0.05)下降，內聚性、回復性顯著增加(P<0.05)，可能是超高壓處理能增強蛋白質非共價鍵強度，致使魚糜凝膠結構更緊湊，從而形成內聚性更好的凝膠網絡結構[25]。超高壓處理能夠明顯改善低鹽魚糜的質構特性，可作為降低白鰱魚糜食鹽添加量的一種有效手段。

圖5 壓力、保壓時間和溫度的交互作用對低鹽魚糜凝膠持水性的影響Figure 5 Effects of pressure, holding time and temperature interaction on WHC of low-salt surimi gels表5 凝膠特性結果驗證?

樣品硬度/g黏附性/(g·s)咀嚼度內聚性回復性凝膠強度 /(g·cm)持水性/%1.5% NaCl2 326.91±208.20a-73.77±1.22c1 738.51±99.23a0.78±0.07b0.41±0.12b203.92±9.93c67.83±1.50c2.5% NaCl2 286.02±132.10b-53.38±3.24b1 633.98±77.30b0.80±0.10b0.42±0.02b214.87±8.21b69.34±2.60bUHP+1.5% NaCl1 988.02±210.90c-38.49±2.11a1 266.17±53.44c0.85±0.03a0.46±0.06a258.24±1.00a71.92±0.27a

? UHP：300 MPa/10 min；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析 肌球蛋白重鏈(MHC，200 kDa)和肌動蛋白(Actin，43 kDa)是魚糜蛋白中的主要成分，其中MHC是肌球蛋白分子中參與凝膠網絡結構形成的最主要部分。由圖6可知，幾種魚糜的肌球蛋白重鏈(MHC，200 kDa)有較大變化，而肌動蛋白條帶無明顯差異；添加2.5% NaCl的普通魚糜凝膠MHC條帶與添加1.5% NaCl的低鹽魚糜凝膠MHC條帶的強度沒有明顯變化，但相比較而言，添加1.5% NaCl的低鹽魚糜凝膠MHC條帶強度略強；而超高壓處理的低鹽魚糜凝膠的MHC條帶強度明顯減弱。Cando等[26]研究表明，超高壓魚糜凝膠的MHC條帶強度明顯低于對照組凝膠，本研究結果與其類似。這可能是肌原纖維蛋白聚集成大分子，無法通過聚丙烯凝膠的微孔，導致其停留在濃縮膠上，使得電泳條帶變弱[27]。圖6中高壓組的MHC條帶強度明顯減弱，可見超高壓組的蛋白質聚合程度高于未處理組，超高壓處理使更多的蛋白質分子通過非二硫共價鍵促進分子內及分子間的交聯形成，從而影響著最終凝膠的品質[28]。因此，高壓能誘導魚糜中肌球蛋白發生變性，從而改善低鹽魚糜的凝膠特性。

a. 2.5% NaCl b. 1.5% NaCl c. 300 MPa/10 min，添加1.5% NaCl

M. 標準蛋白

圖6 魚糜凝膠SDS-PAGE圖

圖6 SDS-PAGE pattern of surimi gels

2.3.3 微觀結構觀察 圖7為魚糜凝膠掃描電鏡圖，由圖7可知，超高壓處理后的低鹽魚糜凝膠網絡結構與添加1.5%，2.5% NaCl的魚糜凝膠網絡結構明顯不同。與添加2.5% NaCl的魚糜凝膠網絡結構相比，添加1.5% NaCl的魚糜凝膠表面相對不平整，孔隙大，凝膠結構松散不均勻。而超高壓(300 MPa/10 min)的低鹽魚糜凝膠表面比較均勻平整，結構致密，孔洞數量明顯減少。超高壓處理可以增強凝膠基質密度和消除一些孔洞，形成光滑、連續、均勻的凝膠。超高壓形成的致密凝膠網絡結構與更高的持水性和破斷力有關，從而形成良好的凝膠[29]，這也驗證了前文中凝膠強度和持水性的相關結果。這可能是超高壓能夠誘導白鰱魚糜蛋白質發生有利于聚合形成立體凝膠網絡結構的均勻變性[25]，具有更高的持水性和凝膠強度，從而改善魚糜凝膠特性。因此，超高壓能夠在一定程度上改善低鹽魚糜凝膠的微觀結構。

圖7 魚糜凝膠掃描電鏡圖Figure 7 Micrographs of surimi gels (×10 000 times)

3 結論

超高壓制備低鹽白鰱魚糜凝膠的最佳工藝條件為：壓力306.22 MPa，保壓時間10.64 min，溫度26.95 ℃，此時魚糜凝膠強度為258.24 g·cm，持水性為71.92%。超高壓處理的低鹽魚糜內聚性、回復性顯著高于常壓低鹽對照組(1.5% NaCl，0.1 MPa)和常壓普通魚糜對照組(2.5% NaCl，0.1 MPa)(P<0.05)；SDS-PAGE蛋白電泳和凝膠微觀掃描結果表明，超高壓處理的低鹽魚糜的肌球蛋白重鏈條帶強度明顯變弱，且形成了一個密集的、細致均勻的三維網絡結構，明顯優于2個常壓對照組。因此，超高壓技術可以提高低鹽白鰱魚糜的凝膠品質。然而，有關超高壓提高低鹽白鰱魚糜凝膠品質的機制還有待進一步研究。