超聲波輔助提取紅汁乳菇中酚類物質的工藝優化

林 海 熊國紅 何建國 張嘯怡

(益陽市產商品質量監督檢驗研究院，湖南 益陽 413000)

紅汁乳菇(LactariushatsudakeTanaka)是擔子菌綱、傘菌目、紅菇科、乳菇屬野生食用真菌。廣泛分布于中國遼寧、河北、江蘇、吉林、湖南、浙江、四川、青海和臺灣等省[1-3]。由于其子實體味道鮮美且獨特，富含人體所必須的維生素、氨基酸和礦物質[4-5]，深受人們的喜愛。紅汁乳菇是一種外生食用菌根菌，由松樹、杉樹等針葉樹種的根與菌根真菌形成共生體，由于生長條件的限制，其人工栽培至今未獲得實質進展，市場上所出售的都是野生菌[6]。

目前關于紅汁乳菇酚類成分及其生物活性的研究相對較少， Moro等[7]發現乳菇屬真菌提取物具有較好的抗炎活性，能抑制炎癥因子NO的產生，iNOS、IL-1β、IL6的表達；Palacios等[8]研究了8種食用菌中酚類物質的抗氧化活性，發現乳菇屬真菌松乳菇的甲醇提取物對亞油酸自氧化抑制率高達50%；Cheung等[9]也通過對食用菌中多酚的研究發現多酚含量與其抗氧化活性呈正相關；已有研究[10]證明植物中的多酚也具備抗腫瘤作用，以及抑菌消炎、抗病毒、護肝益腎等生理活性。目前尚未發現關于紅汁乳菇中酚類提取工藝優化的研究報道，本研究擬對紅汁乳菇中酚類提取工藝進行優化，并研究其生理活性，旨在為紅汁乳菇用作保健食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅汁乳菇：購買于長沙市馬王堆農貿市場；

沒食子酸標準品：含量≥97.5%，美國Sigma-aldrich公司；

鎢酸鈉、鉬酸鈉、濃磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、雙氧水：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

無水乙醇、甲醇：分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設備

冰箱：BCD-190E型，伊萊克斯電器有限公司；

粉碎機：FW100型，北京科偉永興儀器有限公司；

可見光分光光度計：721G型，上海儀電分析儀器有限公司；

離心機：TD4K-Z型，東旺儀器有限公司；

超聲波清洗機：KQ-300DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

分析天平：SOPTOP型，舜宇恒平儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品鑒定 在長沙市馬王堆農貿市場所購買的樣品，經由聯川生物公司ITS測序，將其所測序列與美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotecnology Information)數據庫比對后驗證其為紅汁乳菇。

1.3.2 紅汁乳菇的處理 將采得的新鮮紅汁乳菇去除泥垢后，立即放入冰柜，使其中自由水在低溫下結冰，將凍住的紅汁乳菇置于真空冷凍干燥機中凍干處理，待真空冷凍干燥機達到其最低真空度6 Pa，并持續至少2 h后即可拿出，經粉碎機粉碎后過80目篩網。

1.3.3 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu比色法[11-13]，用沒食子酸作為對照，配制成一定濃度后，與Folin-Ciocalteu顯色劑反應2 h后，在760 nm吸收波長測定其吸光值，繪制相應標準曲線，其回歸方程為y=0.014 67x+0.038 7，R2=0.999 7。由此方程算得紅汁乳菇中總酚含量。并根據此含量算得酚類物質的提取得率。

提取率得率=提取物質量/提取原料質量。

(1)

1.3.4 單因素試驗設計

(1) 溶劑及其濃度：稱取紅汁乳菇粉末1 g，分別加入不同濃度(30%，50%，60%，70%，80%，90%，100%)甲醇20 mL，室溫下超聲提取60 min，加入不同濃度(30%，50%，60%，70%，80%，90%，100%)乙醇20 mL，室溫下超聲提取60 min。

(2) 料液比：稱取紅汁乳菇粉末1 g，加入不同量的60%乙醇溶液(5，10，15，20，25，30 mL)，室溫下超聲提取60 min。

(3) 提取時間：稱取紅汁乳菇粉末1 g，加入60%乙醇溶液20 mL，室溫下超聲提取不同時間(20，40，60，80，100，120 min)。

(4) 提取次數：稱取紅汁乳菇粉末1 g，加入60%乙醇溶液20 mL，室溫下超聲提取60 min，分別提取1，2，3，4次。

1.3.5 響應面試驗 采用Box-Behnken設計，將總酚含量作為響應值，采用三因素三水平的設計，對提取時間、料液比、提取液濃度進行優化，由此推算出最佳條件，并驗證其可靠性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 提取溶劑的選擇對提取效果影響 由圖1可知：不同濃度的乙醇、甲醇溶液對酚類物質的提取有顯著的影響，這是由于不同濃度的甲醇、乙醇溶液有不同的極性，當極性與紅汁乳菇中酚類物質的極性相似時，其相應的提取得率會提高[14]。總酚提取得率總體趨勢呈現先上升后下降，這是由于一定濃度的有機溶劑能夠破壞酚類與多糖和蛋白質之間的氫鍵和疏水作用力，使其提取量增加，而當濃度過高時導致其極性差異大反而使提取量減少[15]。

從選用提取劑的效果可明顯看出來：乙醇>甲醇，且乙醇較甲醇來說是一種廉價、無毒的溶劑，故采用乙醇作為提取液。在乙醇濃度為50%～70%時，總酚的提取量能達到最高值，故選擇乙醇濃度為50%～70%作進一步優化。

圖1 溶劑對紅汁乳菇總酚提取效果的影響Figure 1 Effects of solvents on the extraction of phenolics from Lactarius deliciosus

2.1.2 料液比對提取效果的影響 由圖2可知：隨著溶液提取體積不斷的提高，酚類提取得率也不斷上升，且上升趨勢逐漸變緩。隨著提取液增多，紅汁乳菇粉末與溶劑接觸更充分，且要使酚類析出到溶液而達到與低溶劑量相同的動態平衡狀態需要析出更多的酚類，而料液比超過1∶20 (g/mL)時提取得率趨于穩定，說明此時酚類物質已基本溶出。

圖2 料液比對紅汁乳菇總酚提取效果的影響

圖2 Effects of solid-liquid ratio on the extraction of phenolics from Lactarius deliciosus

2.1.3 提取時間對提取效果的影響 由圖3可知：提取時間對紅汁乳菇總酚提取效果的影響呈現出先上升后下降的趨勢。在80 min以前提取量不斷增加，而到了100 min以后提取量不斷減少。由于物質擴散到溶液需要時間，固在80 min左右提取量呈現持續上升趨勢，而隨著時間的推移，超聲提取產生熱量導致提取溫度不斷的升高，且氧氣與酚類反應的時間也相應加長，導致酚類氧化損失增多，提取得率下降[16]。因此提取時間應該在80 min左右。

圖3 提取時間對紅汁乳菇總酚提取效果的影響

圖3 Effects of extraction time on the extraction of phenolics from Lactarius deliciosus

2.1.4 提取次數對提取效果的影響 由圖4可知：隨著提取次數的增多，酚類提取量雖然呈現上升趨勢，但提取2次后上升趨勢不太顯著。隨著提取次數的增多，導致溶劑消耗量陡增，且后期濃縮更費時費力，故只需提取2次。

圖4 提取次數對紅汁乳菇總酚提取效果的影響

圖4 Effects of extraction times on the extraction of phenolics from Lactarius deliciosus

2.2 響應面優化結果及分析

根據選取的3個優化因素，以總酚含量作為響應值(Y)設計的Box-Behnken試驗。其相應的因素水平和試驗設計見表1、2。

2.2.1 二次回歸方程及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6 Trial對試驗的17組數據進行回歸分析并擬合，得到：

Y=4.83+0.13A+0.30B-0.037C-0.089AB+0.037AC-0.11BC-0.54A2-0.16B2-0.20C2。

(2)

由表3可知，該模型P<0.000 1，表明該模型非常顯著，是一個可靠的模型；A、B2、C2對響應值影響顯著；B、A2對響應值影響極其顯著；由F值的大小可以判斷各因素對總酚提取量的影響大小依次是B>A>C；失擬項P=0.397 5>0.05，表明模型預測值與實際誤差值較小，可以采用該數學模型來推測試驗結果。

2.2.2 響應面結果分析 由圖5(a)可知，在一定的范圍內，當料液比一定時，多酚提取量隨提取時間的延長先上升后下降；當提取時間一定時，多酚提取量隨溶劑量增大而增大。

由圖6(a)可知，在一定的范圍內，當料液比一定時，多酚提取量隨乙醇濃度增大先上升后下降；當乙醇濃度一定時，多酚提取量隨溶劑量增大而增大。

由圖7(a)可知，在一定的范圍內，當乙醇濃度一定時，多酚提取量隨時間延長先上升后下降；當時間一定時，多酚提取量隨乙醇濃度增大先上升后下降。

2.3 優化及驗證

采用Design-Expert 8.0.6 Trial，通過設定提取總酚含量最大值，對超聲波輔助提取多酚進行優化，得到最優條件為：乙醇濃度56.33%、料液比1∶25 (g/mL)、提取時間80.49 min、提取2次，總酚得率可達到4.993 65 mg/g。為便于操作，對最優工藝參數進行調整：乙醇濃度56%、料液比1∶25 (g/mL)、提取時間80 min、提取2次。

表1 響應面試驗因素表Table 1 Response surface test factor level tables

為了進一步驗證Design-Expert 8.0.6 Trial軟件給出的回歸方程的準確性，采用上述最優條件進行3次驗證實驗，得到總酚平均得率為5.046 38 mg/g，與所預測值誤差為1.05%，證明該方程可以有效得到最優提取條件。

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Response surface test plan and results

表3 Box-Behnken試驗方差分析?Table 3 Results of regression analysis of Box-Behnken

?R2=0.975 1，R2adj=0.943 1，R2Pred=0.785 9。

圖5 提取時間及料液比對多酚提取量的影響Figure 5 The influence of time and solid-liquid ratio on the content of polyphenol

圖6 料液比及乙醇濃度對多酚提取量的影響Figure 6 The influence of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the content of polyphenol

圖7 提取時間及乙醇濃度對多酚提取的影響Figure 7 The influence of ethanol concentration and time on the content of polyphenol

3 結論

試驗表明本工藝提取紅汁乳菇中的多酚是一種可靠、有效的方法，具有技術可行性，該工藝可顯著提高酚類物質的提取得率。根據此工藝提取的物質可較大程度地保留紅汁乳菇中的酚類物質，后續將利用大孔樹脂對其純化，為探究紅汁乳菇中分離得到的不同酚類物質的抗癌、抗氧化、抗炎、抑菌等生物活性提供物質基礎。