制備雞肉香精用的雞脂酶解—溫和氧化條件研究

于靜洋陳皇女夏書芹張曉鳴

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 啟東市市場監督管理局，江蘇 南通 226200)

天然熱反應肉味香精秉承“味料同源”的理念[1]，憑借其天然營養、風味逼真的特點，沖擊著傳統合成香精的市場，成為現代調味品市場的主力軍。

肉香味的形成機理十分復雜，其反應包括氨基與羰基的美拉德反應、糖降解、肽及氨基酸降解、脂質降解，以及脂質氧化降解產物與美拉德反應產物的反應等。不同種類肉制品的特征風味是由相對應的不同動物脂肪氧化降解得到的產物所提供的[2]，所以，雞脂的氧化降解對于雞肉特征風味的形成尤為重要。直接添加未氧化的脂肪于熱反應體系中，脂肪氧化程度低，難以充分轉化為特征香味物質，從而導致肉特征風味不明顯。因此，在肉味香精制造過程中添加預先氧化的脂肪，既可減少脂肪用量, 也可增強肉味香精的特征風味[3]。很多研究[4-6]報道直接采用原料雞脂進行加熱氧化處理來制備熱反應雞肉香精，可以有效提高雞脂香。但是，為保證產品質量的穩定，目前工業化生產熱反應雞肉香精多采用商用精煉雞脂作為提供雞肉特征風味的原料，因其中含大量抗氧化劑，精煉雞脂性質穩定易于運輸保存。但對于加熱氧化處理卻存在一定困難，低溫加熱難以使其氧化，高溫加熱則不易控制且易產生酸敗異味。

目前，關于雞脂氧化的研究，文獻[7-10]報道通常以現炸鮮雞脂為原料，但是鮮雞脂質量不易控制，工業上難以用其批量生產雞肉香精。為保證質量穩定，工業生產常采用商用精煉雞脂，但其氧化程度難以控制。本研究基于生物酶解技術，擬將商用精煉雞脂酶解后再適度溫和氧化而產生雞肉特征風味前體，進而制備熱反應雞肉香精，期望能制備出與天然清燉雞湯具有非常高相似度的雞肉香精產品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞脂(抗氧化劑VE含量為0.3 g/kg·雞脂)：安徽牧洋油脂有限公司；

脂肪酶：1.0×104U/g，安徽強旺生物工程有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、p-茴香胺、異辛烷、乙醇、酚酞等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

超級恒溫循環槽：MP501A型，上海一恒科學儀器有限公司；

數顯式機械攪拌器：RW20型，德國IKA公司；

pH計：DELTA320型，瑞士Mettler Toledo公司；

玻璃酶反應器： 500 mL型，湖景玻璃儀器廠；

氣相色譜質譜聯用儀：SCIONSQ-456-GC型，德國Bruker公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 雞脂酶解-溫和氧化單因素試驗設計 稱取一定量商用雞脂于酶反應器中，根據不同底物濃度及pH要求添加磷酸鹽緩沖溶液，以400 r/min均勻攪拌，添加適量脂肪酶，在超級恒溫循環槽中酶解-溫和氧化；反應結束后，80 ℃加熱5 min滅酶。

(1) 溫度：控制原料商用雞脂底物濃度為50%，每克雞脂中添加75 U脂肪酶，調節pH為8.0，分別在35，40，45，50，55，60 ℃條件下酶解4 h，測定不同酶解溫度下的雞脂脂解率，研究溫度對雞脂酶解及應用效果的影響。

(2) pH：控制原料商用雞脂底物濃度為50%，每克雞脂中添加75 U脂肪酶，調節pH分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，在40 ℃條件下酶解4 h，測定不同pH環境下的雞脂脂解率，研究pH對雞脂酶解及應用效果的影響。

(3) 酶添加量：控制原料商用雞脂底物濃度為50%，在pH 8.0、40 ℃條件下，每克雞脂中分別添加15，30，45，60，75，90 U脂肪酶酶解4 h，測量酶添加量不同時的雞脂脂解率，研究酶添加量對雞脂酶解及應用效果的影響。

(4) 底物濃度：控制原料商用雞脂底物濃度分別為30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，每克雞脂添加60 U脂肪酶，在 pH 8.0、40 ℃條件下酶解4 h，測量不同底物濃度的雞脂脂解率，研究底物濃度對雞脂酶解及應用效果的影響。

(5) 時間：控制原料商用雞脂底物濃度為30%，每克雞脂中添加60 U脂肪酶，在pH 8.0、40 ℃條件下，分別酶解3，4，5，6，7，8，9 h，測量不同酶解時間的雞脂脂解率，研究時間對雞脂酶解及應用效果的影響。

1.2.2 雞脂高溫氧化 稱取一定量商用雞脂于四口燒瓶中，安裝機械攪拌器、水銀溫度計、冷凝管，同時連接空氣壓縮機，以25 L/h流量通入空氣，置于150 ℃油浴中加熱1.5 h，氧化后迅速冷卻。

1.2.3 美拉德反應制備雞肉香精 將雞骨酶解物、雞脂、半胱氨酸、還原糖以及其他配料、香辛料，按照一定比例放入美拉德反應瓶內持續均勻攪拌，在pH 6.0、100 ℃條件下反應60 min；熱反應結束后，放入冰水浴中迅速冷卻，常溫下過夜熟化，-18 ℃冷凍保存備用。

1.2.4 定量感官評定 邀請15名經驗豐富的感官評定員(5位男性，10位女性，年齡20～50歲)，基于ISO標準對其進行專業培訓，充分討論后針對雞肉香精中雞脂風味品質確定一致的評價標準[11]，確定以雞脂香、油膩味為主要評價指標對雞肉香精進行定量描述分析。

按照1∶20的質量比將雞肉香精稀釋，在60 ℃水浴中保溫10 min后進行感官評定。風味強度采用九點法打分(1：極弱；9：極強)。雞肉香精風味特性描述詞及其定義見表1。

表1 雞肉香精風味特性描述詞及其定義Table 1 Main terms and definition used for profiling taste and aroma of chicken flavor

1.2.5 雞脂理化指標測定

(1) 過氧化值(PV)：按GB/T 5538—2005執行。

(2) 酸值(AV)：按GB/T 5530—2005執行。

(3) 茴香胺值(p-AV)：按GB/T 24304—2009執行。

(4) 皂化值(Is)：按GB/T 5534—2008執行。

(5) 脂解率：按式(1)計算。

(1)

式中：

c——脂解率，%；

AV1——酶解前酸值(以NaOH計)，mg/g；

AV2——酶解后酸值(以NaOH計)，mg/g；

Is——皂化值(以NaOH計)，mg/g。

1.2.6 清燉雞湯的制備 將整雞除掉頭、尾、內臟后，洗凈、切塊，稱取500 g于砂鍋中，加水2 000 g、鹽10 g，小火燉煮2 h 后，立即取中層雞湯200 mL于密封瓶中，冷藏。

1.2.7 氣相色譜質譜聯用分析(GC-MS)

(1) 取5.0 mL雞脂樣品添加4 μL 0.62 μg/μL 1,2-二氯苯甲醇溶液為內標。

(2) SPME條件：60 ℃下吸附30 min，250 ℃下解吸8 min。

(3) GC條件：毛細管色譜柱CP-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣(He)流速1.8 mL/min，不分流；起始柱溫40 ℃，保持3 min，先以5 ℃/min升至90 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持7 min。

(4) MS條件：電子轟擊電離源EI，電子能量70 eV，發射電流35 μA，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，檢測器電壓350 V，掃描范圍35～450 amu[12]11。

1.2.8 氣相色譜質譜—嗅聞系統聯用分析(GC-MS-O) 采用GC-MS對樣品中揮發性成分進行鑒定，查閱相關文獻鑒定揮發性成分以及部分標準物的可能氣味，培訓測評員讓其提前熟知。采用檢測頻率法對樣品中的特征風味活性成分進行檢測，由5位測評員進行嗅聞并記錄。同一時間有3位以上測評員可以感覺到時，則記錄該氣味描述及其保留時間[12]13。

2 結果與分析

2.1 雞脂酶解—溫和氧化工藝優化

2.1.1 溫度對雞脂酶解及應用效果的影響 從圖1(a)可知，溫度對雞脂酶解效果有明顯影響，溫度從35 ℃升至60 ℃時，雞脂脂解率呈先上升再下降趨勢。40 ℃ 時，雞脂脂解率最高，達到37.72%，40 ℃升至60 ℃時，脂解率從37.72%迅速降至0.07%。研究[13]208表明，雞脂酶解最適溫度為40 ℃，溫度過高或過低均會導致脂肪酶活性下降，尤其高溫條件下脂肪酶易失活。從圖1(b)可知，不同溫度下的酶解雞脂對美拉德產物風味也有明顯影響。40 ℃ 的酶解雞脂制得的美拉德產物雞脂香最濃，油膩味較低。55，60 ℃的酶解雞脂制得的美拉德產物油膩味過重，缺乏雞脂香氣，整體風味不協調。因此，在40 ℃條件下酶解雞脂最為合適。

2.1.2 pH對雞脂酶解及應用效果的影響 由圖2可知，pH對雞脂脂解率有明顯影響。pH 8.0時，雞脂酶解率最高為37.72%；pH 9.0時，雞脂脂解率最低，僅有11.33%。這與不同pH環境下脂肪酶活性不同有關，過高或者過低的pH環境均會降低脂肪酶活性[13]205。感官結果也顯示pH 8.0環境下獲得的酶解雞脂制得的雞肉香精雞脂香味最強、油膩味較低，整體風味更為逼真；雞脂酶解pH為5.0時，美拉德反應產物雞脂香不足，并有腥異味；pH 9.0時，油膩味過重，掩蓋了雞脂香，且焦糊味較重。綜合看來，pH 8.0是雞脂酶解的最適pH環境。

圖1 溫度對雞脂酶解及應用效果的影響

圖1 Effects of enzymatic temperature on enzymatic hydrolysis and application of chicken fat (n=2)

圖2 pH對雞脂酶解及應用效果的影響

圖2 Effects of enzymatic pH on enzymatic hydrolysis and application of chicken fat (n=2)

2.1.3 酶添加量對雞脂酶解及應用效果的影響 從圖3可知，隨著脂肪酶含量的增加，雞脂脂解率總體呈逐漸上升趨勢。在每克雞脂中，酶添加量從15 U上升至90 U，雞脂脂解率幾乎呈直線上升；但酶添加量>60 U后，脂解率變化趨勢變緩。根據酶的作用機制[13]204，通常認為當酶濃度<<底物濃度時，酶催化反應速度與酶的濃度呈正比。因此，當時間與總量一定時，雞脂脂解率隨酶添加量的增加呈線性增加；然而酶濃度較高時，底物濃度相對不足，從而導致酶解速率下降、整體脂解率變化不明顯。雞脂酶解時酶添加量的變化對后期熱反應產物的風味也有一定影響，產品雞脂香的變化趨勢與雞脂脂解率較為一致，油膩味強度變化略有波動。因此，每克雞脂中添加60 U脂肪酶時酶解效果最佳。

2.1.4 底物濃度對雞脂酶解及應用效果的影響 由圖4可知，隨著底物濃度的增加，雞脂脂解率逐漸降低。底物濃度從30%升至90%，雞脂脂解率從42.12%降至29.26%。酶解反應需要水來維持酶分子構象，在油與水界面處的酶反應活性最大，因此，在雞脂底物濃度不斷增大的過程中，體系中的水分相對降低，導致水分與酶接觸的充分程度降低，從而降低酶活性，相同時間內雞脂脂解程度降低[14]。同時，隨著雞脂酶解底物濃度的增加，后期美拉德反應產物的雞脂香逐漸降低、油膩味逐漸升高，但總體變化不明顯。低于30%的底物濃度可能會有更高的脂解率，但生產效率較低，因此，雞脂酶解的最適底物濃度選擇為30%。

2.1.5 時間對雞脂酶解及應用效果的影響 從圖5可知，隨著酶解時間的延長，雞脂脂解率逐漸升高。反應初期，雞脂脂解率增加較快，酶解時間從3 h升至6 h，雞脂脂解率從35.84% 升至45.18%。反應后期，脂解率增長緩慢，酶解時間從6 h升至9 h，脂解率僅從45.18%升至46.19%。這是因為隨著反應進行，底物濃度逐漸降低，酶活性也逐漸降低，從而導致反應速率下降。同時，逐漸增多的酶解產物會占領酶與底物的結合位點，從而抑制酶與底物結合，或者產物占據了底物的重要催化部位，阻礙酶發揮催化作用[15]。感官評定結果表明雞脂酶解時間對美拉德產物雞脂香的影響與雞脂脂解率的變化較為一致。隨著酶解時間的延長，美拉德反應產物的雞脂香逐漸增強，同時油膩味也逐漸降低，總體風味濃郁度與逼真度逐漸升高。前6 h風味變化較為明顯，后3 h風味變化緩慢。因此，雞脂酶解的最佳時間選擇為6 h。

圖3 酶添加量對雞脂酶解及應用效果的影響

圖3 Effects of lipase concentration on enzymatic hydrolysis and application of chicken fat (n=2)

圖4 底物濃度對雞脂酶解及應用效果的影響

圖4 Effects of substrate concentration on enzymatic hydrolysis and application of chicken fat (n=2)

圖5 時間對雞脂酶解及應用效果的影響

圖5 Effects of enzymatic time on enzymatic hydrolysis and application of chicken fat (n=2)

綜上所述，最優雞脂酶解工藝條件為：底物濃度30%，每克雞脂中添加60 U脂肪酶，在40 ℃、pH 8.0條件下，酶解6 h。此時獲得的雞脂脂解率為45.18%，且由其制備的雞肉香精雞脂香濃郁，油膩味較弱。

2.2 不同處理雞脂的氧化程度和應用效果對比

2.2.1 氧化程度分析 脂肪的氧化程度常用PV、AV以及p-AV值表示。其中，PV值表征雞脂氧化的初級產物氫過氧化物含量，經過熱解可提供雞肉香味物質或其前體物；AV值表征羧酸類化合物含量，若AV值過高，會產生嚴重的酸敗味和焦臭味；p-AV值表征羰基化合物特別是不飽和醛類的含量，其含量高低對雞肉風味具有重要影響[16]。分別測定原料商用雞脂、采用2.1最優酶解—溫和氧化工藝條件得到的雞脂和高溫加熱氧化雞脂的PV、AV以及p-AV，結果見表2。

從表2可知，原料商用雞脂的PV、AV和p-AV均較低。經過高溫加熱氧化后，雞脂的PV明顯升高至246.25 meq/kg，AV變化不明顯。雖然p-AV升高可為后續美拉德反應提供更為豐富的風味前體，但過高的PV說明此時油脂已經發生酸敗。經過酶解—溫和氧化之后，雞脂的PV和p-AV有一定升高，AV顯著升高至72.65 mg NaOH/g，這是由于酶的高效催化，脂肪水解成大量脂肪酸，部分脂肪酸氧化生成氫過氧化物與醛、酮等二級產物。

2.2.2 應用效果評價 以上述3種不同氧化程度雞脂為原料，分別制備美拉德反應雞肉香精MCF1(原料商用雞脂)、MCF2(最優酶解—溫和氧化雞脂)、MCF3(高溫加熱氧化雞脂)，并對其進行感官評定分析，結果見表3。

表2 不同雞脂氧化狀態分析Table 2 Oxidation state analysis of different chicken fat (n=3)

表3 不同雞脂制備的雞肉香精感官評定分析Table 3 Sensory evaluation results of chicken flavor with different chicken fat (n=3)

從表3可知，MCF1雞脂香一般、沒有酸敗味，但油膩味過重；MCF3雞脂香和油膩味雖有略微改善，但酸敗味明顯；MCF2雞脂香濃郁，油膩味與酸敗味均有明顯改善。上述結果表明，雞脂的氧化程度與狀態對熱反應雞肉香精的風味品質具有重要影響。商用精煉雞脂經過酶解后，能得到適度氧化，形成雞肉特征風味前體，熱反應雞肉香精風味得到明顯改善。

2.3 基于雞湯風味的相似性分析

采用GC-MS-O技術，基于天然清燉雞湯中揮發性特征風味成分和相對含量鑒定，分析比較雞肉香精MCF1、MCF2與MCF3的揮發性特征風味成分與香氣風格，結果見表4。

從表4可知，清燉雞湯與3種雞肉香精中共檢測出20種雞肉揮發性特征風味成分。飽和醛類物質多具有青草香、花香等氣味，其含量隨著雞脂氧化程度的升高而增加，MCF3樣品以高溫加熱氧化雞脂為原料，其中飽和醛類物質含量明顯高于MCF1和雞湯的，因此有異味產生。不飽和醛類物質多具有雞脂香等氣味，MCF1中的雞脂未經氧化處理，不飽和醛類物質含量明顯低于雞湯中含量，表現為雞脂香不濃郁。MCF2樣品以酶解-溫和氧化雞脂為原料，醛類物質含量適中，公認的雞肉特征風味成分(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛分別為193.37，30.69 μg/100 g，與雞湯的最為接近，雞脂香濃郁、無異味，逼真度最高。

呋喃、吡啶、噻吩、噻唑等雜環類物質可能都是由脂肪氧化降解產物與美拉德反應相互作用形成的，是肉類食品中重要的風味成分[13]321[17]，其中2-戊基吡啶、2-乙酰噻唑等含量都隨著雞脂氧化程度升高呈先增加后減少的趨勢，MCF2中含量最多，也與雞湯中含量接近，說明經過酶解-溫和氧化的雞脂參與美拉德反應產生的雞肉香精風味最佳。

表4 不同氧化程度雞脂制備的雞肉香精與清燉雞湯的揮發性成分比較?Table 4 Comparison of volatile compounds content in 3 different chicken flavors and chicken broth

? --代表樣品中未檢出。

硫醇及硫醚類物質具有肉味、硫味、咖啡等風味，是肉類特征風味物質，但是肉香中的硫酯、硫醚類物質閾值較低[13]323，含量過高反而會形成硫臭味，MCF1樣品中雙(2-甲基-3-呋喃)二硫醚與2-甲基-3-呋喃硫醇等物質含量遠遠高于雞湯中含量，表現出明顯硫臭味。MCF2中含硫成分含量適中，肉香味醇厚；MCF3中含硫化合物含量較低，肉味不足。

本研究基于上述20種檢測到的雞肉特征風味成分，計算出雞肉香精與清燉雞湯中風味成分含量的比值，繪制了雞肉特征風味相似度雷達圖，結果見圖6。從圖6可知，MCF2風味成分曲線與清燉雞湯重合度最高。經過pearson相關性分析，MCF2與清燉雞湯的相似度高達98.65%，MCF1和MCF3與清燉雞湯的相似度僅有47.38%和84.04%，說明商用精煉雞脂不經任何處理直接制備的熱反應雞肉香精風味較差、逼真度極低；雞脂經過高溫氧化處理后，香精的雞肉特征風味有所改善；雞脂經過酶解-溫和氧化之后再進行熱反應制備的香精，雞肉特征風味明顯，幾乎與清燉雞湯風味一致。

圖6 雞肉特征風味相似度雷達圖Figure 6 The Radar fingerprint of chicken flavor similarity

綜上可知，參與美拉德反應的雞脂，需要經過適當氧化處理才能達到天然清燉雞湯的風味，但是雞脂經高溫氧化容易形成異味而導致逼真度降低。雞脂經過酶解—溫和氧化后，氧化程度適當，雞肉香精的特征風味明顯，肉味醇厚、脂香濃郁，與天然清燉雞湯相似度更高。

3 結論

雞脂酶解-溫和氧化的優化工藝條件為雞脂底物濃度30%，脂肪酶用量為60 U/ g·雞脂，在pH 8.0、40 ℃條件下酶解6 h時，獲得的雞脂脂解率高達45.18%。

以PV、AV和p-AV為指標，分析比較了不經任何處理、經過最優酶解—溫和氧化和高溫加熱氧化處理3種雞脂的氧化程度。對3種雞脂制備的熱反應香精MCF1、MCF2、MCF3進行了初步感官評價，發現MCF1雞脂香一般但油膩味過重；MCF3雞脂香和油膩味雖有略微改善，但酸敗味明顯；MCF2雞脂香濃郁，油膩味與酸敗味均有明顯改善。

基于天然清燉雞湯，利用GC-MS-O分析比較了雞肉香精MCF1、MCF2與MCF3的揮發性特征風味成分及香氣風格，證實經酶解溫和氧化雞脂制得的雞肉香精雞肉香氣最飽滿、雞脂香最濃郁、與天然雞湯的相似度最高。需要指出的是，本研究以清燉雞湯為對照，篩選出風味最為逼真的雞脂氧化條件，今后可針對燒烤雞肉、炸雞肉等不同風格的雞肉特征風味開展系列研究，為實際生產提供理論基礎。