加鹽量對人工發酵豆豉后發酵中理化特性及抗氧化活性的影響

萬 俊程偉偉沈小璐蔣愛民

(1. 廣東農工商職業技術學院熱作系，廣東 廣州 510507；2. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；3. 華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642)

中國豆豉生產歷史悠久，主要采用傳統的自然發酵方式，生產周期較長，菌種種類不清，產品質量不穩定，存在安全隱患等問題。而且企業規模較小，無系統的工業化生產。對此，中國研究人員也開展了一系列的工作，如：張建華[1]系統探究了瀏陽豆豉發酵的機理，對其優良菌種進行選育并且進行發酵工藝的優化改良；吳擁軍等[2]強化了RH3519菌株純種發酵細菌型豆豉的研究，促進了其工業化生產；謝亮等[3]為了克服純種發酵帶來的風味和功能營養方面的不足，采用納豆菌和曲霉混菌的方式對豆豉的發酵工藝進行研究及優化；劉錦繡等[4]在菌種選育鑒定、純種/混菌發酵工藝及條件優化方面做了很大的努力。

本試驗擬將實驗室前期從陽江豆豉里分離篩選出的菌株，剔除致病菌群，在研究單一純種發酵豆豉成品品質及抗氧化功能特性不理想的基礎上，以陽江豆豉為陽性對照，進行人工多菌種發酵，測定后發酵時通過添加不同的食鹽量，研究含鹽量對豆豉硬度、色澤、氨基態氮、成品感官等指標以及抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與原料

黑豆、豆豉：由陽江陽帆豆豉廠惠贈，分包真空包裝于-18 ℃ 以下保存；

菌種：由廣東省畜禽產品加工工程技術研究開發中心實驗室前期從陽江豆豉中分離冷凍保存；

食鹽：購于華南農業大學三角市。

1.1.2 主要試劑

平板計數瓊脂(PCA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)：生化試劑，廣東環凱微生物科技有限公司；

氫氧化鈉：分析純，廣州化學試劑廠；

中性甲醛溶液：分析純，天津化學試劑廠；

二苯代苦味基肼自由基(DPPH·)：分析純，百靈威公司。

1.1.3 主要儀器

恒溫恒濕培養箱：HPX-160BS-Ⅲ型，上海新苗醫療器械有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-2FD型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

手提式高壓蒸汽滅菌鍋：YD-280型，合肥華泰醫療設備有限公司；

精密pH計：pHS-3型，上海精密科學儀器有限公司；

質構儀：TA-XT plus型，英國SMS公司；

生化培養箱：SPX-80BS-II型，上海新苗醫療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人工多菌種發酵豆豉的制備 將從陽江豆豉里分離篩選出的14株有效菌株：5種酵母(11101，11602，11701，11301，11102)、2種霉菌(10501，11604)、7種細菌(10601，10901，11702，11703，11704，11302)分別接至酵母、細菌、霉菌的3個液體培養基擴大培養，按照2%的接種量接種(接種比例霉菌∶細菌∶酵母=10∶1∶1，后發酵開始時再加入酵母菌)。制作工藝：

黑豆→篩選→浸豆→蒸煮→冷卻→接種(霉菌和細菌)30 ℃制曲5 d→洗曲→拌鹽(8%，10%，12%)→加酵母(35 ℃ 后期發酵30 d)→55 ℃鼓風干燥即得成品

1.2.2 后發酵過程中pH值的測定 稱取5.00 g樣品，用蒸餾水定容至50 mL，高速勻漿機中打漿，靜置30 min，測定pH值。

1.2.3 后發酵過程中總酸的測定 稱取打碎后的樣品5 g，加水定容于100 mL，高速勻漿機打漿；4 ℃靜置1 h后，取上清液20 mL置于200 mL燒杯中，加60 mL水，開啟磁力攪拌器，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至酸度8.2，記錄消耗的NaOH溶液的量，用直接加80 mL蒸餾水做空白，按式(1)計算總酸含量(以乳酸計，10-3mol的NaOH相當于0.09 g乳酸)。

ω=(V1-V2)×C×9，

(1)

式中：

ω——總酸含量，g乳酸/100 g；

V1——滴定消耗氫氧化鈉的體積，mL；

V2——空白消耗氫氧化鈉的體積，mL；

C——滴定用氫氧化鈉的濃度，mol/L。

1.2.4 后發酵過程中不同時期硬度和咀嚼性的測定 原料處理：1顆豆/次；平行測15次，取平均值。

參考Li等[6]的方法，略有修改。采用TPA(Texture Profile Analysis)質地剖面分析法，使用質構儀測定。測定參數：探頭類型P36R；測前速度2 mm/s，測中速度1 mm/s，測后速度10 mm/s；壓縮比70%；負重5 g。

1.2.5 后發酵過程中色澤的測定 取一定量發酵過程中的豆豉，在高速勻漿機中打碎，平鋪在平板的背面。

采用Lab值系統。L=0 表示黑色，L=100 表示白色；a值越大，越接近純紅，a值越小，越接近純綠；b值越大，越接近純黃，b值越小越接近純藍。采用X-Rite SP62型色差儀進行測定，測6次取平均值。

1.2.6 后發酵過程中Fe3+還原能力的測定 取一定量打碎后的樣品粉末，加蒸餾水配成5 mg/mL溶液，高速勻漿機勻漿，抽濾后待用。

參考Oyaizu的方法[7]。取0.5 mL處理好的樣品，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和1%的鐵氰化鉀溶液各0.5 mL，50 ℃保溫20 min后再加入10% 的三氯乙酸溶液0.5 mL，混合后加入蒸餾水2 mL以及0.1% 三氯化鐵溶液0.4 mL，室溫反應10 min后，測定其在700 nm處的吸光值A。

1.2.7 豆豉中γ-聚谷氨酸(γ-PGA)含量的測定 取1 mL豆豉提取液與3 mL的乙醇混合(1∶3)，4 500 r/min 離心10 min。去上清液，沉淀添加5 mL蒸餾水、2.5% 的CET(溴化十六烷基三甲銨)1.0 mL，靜置20 min，于400 nm下測吸光度，蒸餾水做空白。γ-PGA含量按式(2)計算：

m=(A-B)×0.125×0.877 6，

(2)

式中：

m——γ-PGA 含量，g乳酸/100 g；

A——樣品的吸光度；

B——空白測定的吸光度。

1.2.8 感官評定 參考孫森等[8]的方法。豆豉的感官指標主要從色澤、香氣、滋味、形態四方面考慮，每個指標滿分5分。評分標準見表1，評分越高，總體越好。

表1 豆豉感官品質評定標準Table 1 Sensory quality assessment of douche

2 結果與分析

2.1 對豆豉pH值和總酸的影響

不同鹽度發酵豆豉的pH值與總酸的變化見圖1。方差分析結果表明：含鹽量對豆豉pH值的影響顯著(P<0.05)，對總酸的影響極顯著(P<0.01)。由圖1可知，在后發酵過程中，不同鹽度豆豉的pH值隨著發酵的進行都有減小的趨勢。起初，3種含鹽量的豆豉pH值差異不大，最終8%含鹽量的豆豉pH值最大，為7.08。總酸在后發酵過程中逐漸增加，且后期增長較緩慢。10%和12%含鹽量的豆豉發酵過程中總酸含量及變化相差不大，隨著加鹽量的減少，總酸含量最低，與pH值結果相一致。分析原因可能是，高鹽環境中乳酸菌等耐鹽厭氧菌生長繁殖比較旺盛，產酸較多，酸度較大[9]。

圖1 后發酵過程中加鹽量對豆豉pH、總酸的影響Figure 1 Effect of salt content on pH and total acid during post-fermentation of douchi

2.2 對豆豉硬度和咀嚼性的影響

不同鹽度的豆豉后發酵過程中硬度和咀嚼性的變化見圖2。方差分析表明，鹽度對豆豉硬度和咀嚼性的影響極顯著(P<0.01)。由圖2可知，硬度和咀嚼性在后發酵的過程中都逐漸減小，成品烘干后水分大量散失，使其數值驟然增大。隨著鹽度的增加，硬度和咀嚼性越來越大，含鹽量10%，12%的豆豉硬度和咀嚼性顯著大于含鹽量8%的。主要原因是高鹽度對酶的活性有抑制作用，另外，鹽度越高水分散失越多[10]。

2.3 對豆豉色澤的影響

不同含鹽量的豆豉后發酵過程中L、a、b值見圖3。第2周之后，逐漸出現差異，隨著鹽度的降低，L值變小；含鹽量8%的豆豉a值顯著高于10%，12%的(P<0.05)。這與Wang等[9]的研究具有一致性。據報道，L值和a值與美拉德反應有顯著的負相關性[11]，鹽濃度與美拉德反應的產物呈負相關[12]。因而，低鹽會使a值增高，顏色變暗，即L值越小。不同鹽度的豆豉b值在后發酵過程中無明顯差異(P>0.05)，最終成品烘干8%的豆豉b值最小。

2.4 對豆豉Fe3+還原能力的影響

后發酵過程中，不同加鹽量的豆豉對Fe3+還原能力的大小變化見圖4。方差分析結果表明，不同鹽度對豆豉Fe3+還原力的影響顯著(P<0.05)。3種含鹽量豆豉對Fe3+的還原力大小隨著發酵的進行，都有增大的趨勢。并且低含鹽量8%的豆豉樣品增大的最快，最終還原力最大達到0.402 1。綜合以上指標變化可以看出，后發酵階段加鹽量越高其抗氧化能力越低[13]。分析原因可能是，高鹽抑制了發酵過程中一些物質的生化反應，使生成的抗氧化活性物質減少；鹽度過高對微生物的生長產酶及酶活有抑制作用。因而，選擇合適的鹽度和發酵時間是十分必要的。

圖2 后發酵過程中加鹽量對豆豉硬度、咀嚼性的影響

圖2 Effect of salt content on hardness and chewingness during post-fermentation of douchi

圖3 后發酵過程中含鹽量對豆豉色澤的影響Figure 3 Effect of salt content on color during post-fermentation of douchi

圖4 后發酵過程中加鹽量對豆豉Fe3+還原力的影響Figure 4 Effect of salt content on Fe3+ reducing power during post-fermentation of douchi

2.5 對成品豆豉γ-PGA含量的影響

γ-PGA是一種由L-谷氨酸和/或D-谷氨酸通過γ-酰胺鍵結合形成的陰離子聚合物/多肽，具有極強的保濕能力，被廣泛用在食品工業、化妝品、保健、廢水處理、衛生用品、醫療以及水凝膠等領域[14]。表2經過方差分析得，鹽度對豆豉γ-PGA含量的影響極顯著(P<0.01)。隨著鹽度增到12%，對γ-PGA的生成有抑制作用，但3種成品均大于陽江豆豉。主要原因是陽江豆豉含鹽量較高(16%～18%)且為傳統的霉菌型豆豉，γ-PGA是細菌發酵大豆產生的黏性物質的主要成分。試驗豆豉制曲階段用霉菌、細菌混菌發酵也有利于γ-PGA的生成。

2.6 感官評定

由圖5可以看出，后發酵過程中不同的加鹽量對豆豉的色澤、香氣等都有影響。8%含鹽量的豆豉色澤、滋味比較好，但是香氣不夠；12%含鹽量的豆豉香氣不錯，但是滋味過咸，口感過硬，總體的感官評價相差不大。由此，可以得到，8%含鹽量的豆豉雖然感官評定總分不如12%的，但其食鹽含量低，且在后發酵過程中各項理化指標和活性都較高，適口性較強。

表2 不同鹽度豆豉及陽江豆豉γ-PGA含量的比較Table 2 Effect of salt content on γ-PGA during post-fermentation of douchi

圖5 不同含鹽量豆豉成品的感官評定Figure 5 Effect of salt content on sensory evaluation during post-fermentation of douche

3 結論

鹽度對各理化指標有不同程度的影響，鹽度過高會降低其口感、活性物質γ-PGA的含量以及抗氧化能力。從健康和經濟的角度考慮，確定8%含鹽量豆豉較好，與傳統發酵的12%～18%含鹽量相比降低了不少，其缺陷是風味不足。因此，應繼續研究采取一定的措施，在保證鹽度相對較低的情況下，提高其風味，使之更好地被消費者接受。