美拉德反應對芝麻多肽抗氧化活性的影響

錢森和王 洲魏 明薛正蓮

(1. 安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000；2. 安徽工程大學微生物制藥產業共性研究院，安徽 蕪湖 241000)

芝麻多肽是芝麻蛋白經水解后得到的有生物活性的混合小肽，與蛋白質相比，這些小肽易于被人體吸收利用，且具有抗氧化、抗菌、降血壓、調節免疫等生理活性，其中抗氧化作用是其重要的一種生理活性[1-2]。研究[3]表明，芝麻多肽具有清除機體自由基、抑制脂質過氧化以及提高抗氧化酶活性的能力，還能夠降低小鼠血清和肝臟中丙二醛含量，提高肝臟中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性。

美拉德反應是羰基化合物與氨基化合物之間發生的一種復雜反應。美拉德反應對提高蛋白質功能性質以及食品品質方面具有重要作用，通過美拉德反應可以提高蛋白質的溶解性、乳化性、熱穩定性以及膠體穩定性[4]；改變食品的色澤、風味以及營養價值[5]。研究[6]表明，美拉德反應產物中含有類黑精、還原酮以及揮發性雜環化合物，這些物質具有一定的抗氧化性能。

目前采用美拉德反應修飾生物活性肽的研究較多，例如：陳貴堂等[7]制備的灰樹花多肽美拉德反應產物的還原力和DPPH自由基清除能力與等質量濃度的抗壞血酸相當；趙謀明等[8]以草魚肽和木糖制備的美拉德反應產物的褐變程度更高、抗氧化活性更強，且隨時間的延長抗氧化活性逐漸增強。然而，美拉德反應用于改善芝麻多肽抗氧化活性的研究還未見報道。本研究在制備芝麻多肽的基礎上，篩選芝麻多肽美拉德反應的適宜還原性糖及其肽糖比，研究美拉德反應對芝麻多肽抗氧化活性的影響，以期提高芝麻多肽抗氧化活性；并進一步分析芝麻多肽美拉德反應過程中氨基酸組成及含量、褐變程度、接枝度以及紫外吸收光譜的變化，探討芝麻多肽美拉德反應產物抗氧化的機理，為食品中天然抗氧化劑的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄糖、木糖、乳糖、十二烷基磺酸鈉、β-巰基乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過硫酸鉀、乙酸鈉、三氯化鐵、雙氧水：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

堿性水解酶、三氯乙酸、鐵氰化鉀、DPPH、ABTS、鄰二氮菲等：分析純，上海青析化工有限公司；

鄰苯二甲醛、甲醇、乙腈：色譜純，美國Agilent Technologies公司；

芝麻粕：安徽華安食品有限公司；

分析天平：FC-104型，上海精密科學儀器公司；

微型高速粉碎機：FW100型，天津泰斯特儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-6型，江蘇金壇市億通電子有限公司；

離心機：TGL-16型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

高校液相色譜儀： LC-20A型，日本島津公司；

紫外—可見光分光光度計：TU-1800型，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 芝麻多肽的制備 稱取50 g芝麻粕，粉碎后過60目篩，用 0.1 mol/L NaOH溶液在40 ℃恒溫水浴攪拌提取1 h，離心(8 000 r/min，10 min)后，取上清液(芝麻蛋白液)，在堿性蛋白酶(1.0×105U/g)與芝麻蛋白液(10%)的E/S為2%、pH 8.0、酶解溫度40 ℃條件下酶解3 h，反應結束后沸水浴滅酶20 min，冷卻后離心(8 000 r/min，10 min)，上清液冷凍干燥后于-20 ℃保存備用。

1.2.2 氨基酸含量測定 取1 mL多肽溶液，加入2 mL三氯乙酸沉淀蛋白后離心(12 000 r/min，10min)，經0.22 μm 膜過濾后采用HPLC法進行氨基酸含量的測定。色譜柱：Thermo Hypersil ODS C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫40 ℃；流動相，水相A：無水醋酸鈉3.06 g，先溶于800 mL水，然后加三乙胺200 μL，四氫呋喃5 mL，ddH2O定容至1 L，醋酸調節pH至7.2，有機相B：無水醋酸鈉3.06 g，ddH2O 定容至200 mL，醋酸調節pH至7.2，然后加入400 mL 甲醇和400 mL 乙腈；流速1 mL/min。采用OPA 試劑進行在線柱前衍生。

1.2.3 芝麻多肽美拉德反應還原糖種類及肽糖比的確定

用蒸餾水將芝麻多肽配置成質量濃度為5%的溶液，分別稱取一定量的葡萄糖、乳糖和木糖，加到芝麻多肽溶液中，使肽糖的質量比分別為2∶1，1∶1，1∶2，1∶3。待完全溶解后用1 mol/L NaOH溶液調pH值至8.0，置于95 ℃水浴2 h，反應后迅速冷卻，得到芝麻多肽美拉德反應產物，并置于-20 ℃保存備用。

1.2.4 芝麻多肽美拉德反應產物的制備 在選取適宜的還原糖和肽糖比的基礎上制備芝麻多肽美拉德反應產物。反應條件同1.2.3，反應時間分別為1，2，3，4 h。

1.2.5 抗氧活性測定

(1) 還原力的測定：根據文獻[9]方法略作修改，取多肽溶液及其美拉德反應產物各0.5 mL于試管中，加入0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)2.5 mL和1.0%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻，于50 ℃保溫20 min后置于冰浴中，并加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混合后于3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2 mL和0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，振蕩均勻后靜置10 min，測定其在700 nm 處的吸光值(A700)。

(2) ABTS+自由基清除率測定：根據文獻[10]方法略作修改，取7.4 mmol/L ABTS溶液2 mL與2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液2 mL，混合后室溫避光放置16 h，用pH 4.5的20 mmol/L 乙酸鈉緩沖溶液稀釋混合液，使其在734 nm處的吸光值(A734)達到0.7±0.02，取2.0 mL稀釋過的溶液與1 mL多肽液混合，靜置6 min后測定A734值。

(1)

式中：

EA——ABTS+自由基清除率，%；

A0——加入去離子水的吸光值；

As——加入樣品的吸光值。

(3) DPPH自由基清除率的測定：根據文獻[11]方法略作修改，取1 mL樣品與4 mL 0.02 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混合，混勻后在室溫避光放置30 min，混合液于3 000 r/min 離心5 min，取上清液，測定517 nm處的吸光值(A517)，用體積比1∶1的無水乙醇與水混合液作為參比。

(2)

式中：

ED——DPPH自由基清除率，%；

A0——空白對照(DPPH+乙醇)的吸光值；

A1——加入樣品時DPPH(樣品+DPPH-無水乙醇)的吸光值；

A2——樣品(樣品+乙醇)的吸光值。

(4) 羥自由基清除率測定：根據文獻[12]方法略作修改，取7.5 mmol/L FeSO4溶液0.2 mL，7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液0.2 mL，樣品溶液0.4 mL，pH 7.4 PBS的溶液2.0 mL，蒸餾水0.8 mL 以及1.0% H2O20.4 mL于試管中，混勻后置于37 ℃ 恒溫水浴60 min，測定其在536 nm處的吸光值。

(3)

式中：

EOH——羥自由基的清除率，%；

A0——以蒸餾水代替樣品測得的吸光值；

A1——以蒸餾水分別代替樣品和H2O2測得的吸光值；

A2——樣品的吸光值。

1.2.6 褐變程度和接枝度的測定

(1) 褐變程度測定：根據文獻[13]方法略作修改，以蒸餾水作為參比，在420 nm處測定芝麻多肽美拉德反應產物的吸光值作為褐變程度。

(2) 接枝度測定：根據文獻[14]方法略作修改，取200 μL 質量濃度為2 mg/mL的芝麻多肽美拉德反應產物，加入鄰苯二甲醛溶液4 mL，混勻后置于35 ℃條件下水浴2 min，測定其在340 nm的吸光值。空白對照組為4.0 mL鄰苯二甲醛+200 μL蒸餾水。

(4)

式中：

DG——接枝度，%；

At——芝麻多肽美拉德反應產物在340 nm的吸光值；

A0——芝麻多肽溶液在相同反應條件下在340 nm的吸光值。

1.2.7 紫外光譜分析 用0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液將芝麻多肽美拉德反應產物稀釋至質量濃度為1 mg/mL，采用紫外-可見光分光光度計全波長掃描。

1.3 數據處理、作圖及統計分析

采用Excel 2010軟件進行數據整理和做圖，用SAS 9.1統計分析軟件進行差異顯著性分析，每個試驗3次重復。

2 結果與分析

2.1 還原糖種類及肽糖比的確定

選取葡萄糖、乳糖和木糖3種代表性還原性糖與不同比例的芝麻多肽進行美拉德反應，研究糖的種類及肽糖比對美拉德反應產物還原力的影響，結果見圖1。由圖1可知，木糖與芝麻多肽發生美拉德反應后產物的還原力最高，而乳糖最低；可能是木糖為五碳糖單糖，其碳鏈短于葡萄糖，空間位阻小，更易于多肽發生美拉德反應；乳糖為還原性雙糖，其分子量較還原性單糖的分子量大，從而導致反應速度較還原性單糖慢[15]。另外，隨著肽糖比例的增加，反應產物的還原力逐漸增加，當肽糖質量比<1∶2時，其還原力增加不明顯。因此，選取木糖與芝麻多肽1∶2的質量比進行后續的試驗。

圖1 還原糖種類及肽糖比例對芝麻多肽美拉德反應產物還原力的影響

圖1 Effect of reducing sugar types and peptide sugar ratios on reducing force of mallard reaction products of sesame polypeptide

2.2 美拉德反應對芝麻多肽鐵氰化鉀還原力的影響

芝麻多肽及其美拉德反應產物的鐵氰化鉀還原力見圖2。由圖2可知，芝麻多肽美拉德反應產物的還原力隨著反應時間的延長明顯增大，在反應前2 h內，反應產物的還原力低于芝麻多肽；但在反應3～4 h時，還原力分別為0.83，0.92，顯著高于芝麻多肽的還原力(P>0.05)。這與Jiang等[16]研究水溶性牛酪肽美拉德產物的還原力隨反應時間延長而增加的結果相一致。

2.3 美拉德反應對芝麻多肽ABTS+自由基清除能力的影響

圖3為芝麻多肽及其美拉德反應產物的ABTS+自由基清除率。由圖3可知，美拉德反應能夠顯著提高芝麻多肽ABTS+自由基的清除能力，且反應產物的ABTS+自由基清除率隨著反應時間的延長而逐漸增加，當反應時間為3，4 h 時，自由基清除率分別為43%，72%，顯著高于芝麻多肽的清除率(P>0.05)。Zeng等[17]研究也表明，美拉德反應產物具有ABTS+自由基清除活性，且清除活性隨反應時間的延長而增加。

Sp表示芝麻多肽；*表示與Sp比較，差異在0.05水平上顯著圖3 美拉德反應對芝麻多肽ABTS+自由基清除率的影響

圖3 Effect of mallard reaction on the ABTS+free radical scavenging rate of sesame polypeptides

2.4 美拉德反應對芝麻多肽DPPH自由基清除能力的影響

圖4為美拉德反應對芝麻多肽DPPH自由基清除率的影響。由圖4可知，美拉德反應能夠顯著提高芝麻多肽DPPH自由基的清除率，當芝麻多肽美拉德反應1～4 h時，產物的DPPH自由基清除率顯著高于芝麻多肽的(P>0.05)。

Sp表示芝麻多肽；*表示與Sp比較，差異在0.05水平上顯著圖4 美拉德反應對芝麻多肽DPPH自由基清除率的影響

圖4 Effect of mallard reaction on the DPPH free radical scavenging rate of sesame polypeptides

2.5 美拉德反應對芝麻多肽羥自由基清除能力的影響

美拉德反應對芝麻多肽羥自由基清除率的影響見圖5。由圖5可知，在1～3 h內，芝麻多肽美拉德反應產物的羥自由基清除能力隨著反應時間的延長而增強，但反應3，4 h自由基清除率差異不明顯。另外，在反應2～4 h，產物的自由基清除率顯著高于芝麻多肽的(P>0.05)。

Sp表示芝麻多肽；*表示與Sp比較，差異在0.05水平上顯著圖5 美拉德反應對芝麻多肽羥自由基清除率的影響

圖5 Effect of mallard reaction on the hydroxyl free radical scavenging rate of sesame polypeptides

2.6 美拉德反應對芝麻多肽游離氨基酸含量的影響

圖6為美拉德反應(4 h)對芝麻多肽游離氨基酸組成與含量變化。由圖6可以看出，芝麻多肽美拉德反應后，體系中游離氨基酸含量發生了變化，含量明顯增加的氨基酸有丙氨酸、纈氨酸；含量明顯減少的氨基酸有賴氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸；其他氨基酸含量基本維持不變。另外，生成了天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸，可能是加熱使得部分小肽發生降解[18]。其中生成的天冬氨酸和谷氨酸是酸性氨基酸，具有較強的抗氧化活性，另外，半胱氨酸的生成也能提高體系的抗氧化活性。

圖6 美拉德反應對芝麻多肽氨基酸組成和含量的影響

圖6 Effect of mallard reaction on the amino acid composition and contents of sesame polypeptides

2.7 美拉德反應的褐變程度及接枝度變化

美拉德反應褐變程度通常可以反映接枝反應的速率，褐變程度越強，表明接枝反應越快[19]。芝麻多肽美拉德反應褐變度與接枝度變化見圖7、8。

圖7 芝麻多肽美拉德反應褐變程度隨時間的變化

圖7 Changes in browning degree of sesame peptide mallard reaction as a function of reaction times

圖8 芝麻多肽美拉德反應接枝度隨時間的變化

圖8 Changes in grafting degree of sesame peptide mallard reaction as a function of reaction times

由圖7可知，芝麻多肽的褐變程度均隨著反應時間的延長而逐漸增大，在反應4 h時，其420 nm處吸光值為1.45。另外，隨著反應的進行產物顏色也逐漸加深，表明生成的類黑精也越來越多，其抗氧化活性越來越強[20]。

通過測定體系中自由氨基基團含量變化，可以反映出美拉德反應的進程[21]。從圖8可以看出，芝麻多肽美拉德反應的接枝度也隨時間延長而明顯增大，在4 h時其接枝度為26.4%。由此可知，芝麻多肽美拉德反應的接枝度變化與褐變趨勢基本相符，接枝度變化能夠反映出褐變程度。

2.8 美拉德反應產物的紫外光譜

紫外光譜是美拉德反應產物結構表征與分析的重要手段，可以通過測定美拉德反應產物的紫外吸收峰來判斷其結構的變化。由圖9可以看出，芝麻多肽及其美拉德反應產物在210 nm左右具有較強的吸收峰，而這一吸收峰能夠表征肽鍵的變化。隨著反應時間的延長，美拉德反應產物吸收峰的最大值逐漸增大，與褐變程度和接枝度的變化相一致；且隨著反應的進行，其光譜發生了紅移現象，說明氨基酸基團周圍微環境極性增強，疏水性減弱，使得多肽的結構變得更加松散[22]。另外，在260 nm處也有一吸收峰，這一吸收峰正是類黑精的特征，且隨著反應時間的延長，其吸收峰的最大值也逐漸增加，表明隨著反應的進行生成的類黑精逐漸增多[23]。

圖9 芝麻多肽及其美拉德產物的紫外光譜掃描Figure 9 UV spectrum scanning of sesame polypeptide and its mallard products

3 結論

研究表明，芝麻多肽美拉德反應的適宜肽糖質量比為1∶2；美拉德反應能夠提高芝麻多肽抗氧化活性，隨著反應時間的延長，其還原力、ABTS+自由基清除能力、DPPH自由基清除能力以及羥自由基清除能力逐漸增強。美拉德反應改變了芝麻多肽中游離氨基酸組成和含量，生成的酸性氨基酸具有一定的抗氧化活性。芝麻多肽美拉德反應的褐變程度和接枝度隨著反應時間的延長而增大，其產物的顏色逐漸加深，表明生成的產物逐漸增多。紫外光譜掃描分析表明，芝麻美拉德反應能夠改變芝麻多肽的肽鍵，隨著反應的進行，特征峰的吸光值逐漸增多，表明生成的類黑精物質逐漸增多。美拉德反應是一個復雜的過程，影響其產物抗氧化活性的因素較多，在后期的工作中將進一步深入研究。