雞矢藤顆粒劑干預大鼠肝纖維化模型OPN與TGF-β1水平表達的試驗研究

袁 勇

(海南醫學院，海南 海口 570102)

肝纖維化是肝硬化、肝癌等多種肝病的共同病理過程。它可由多種損肝因素(如病毒性肝炎、酒精性肝病、脂肪肝、藥物及化學毒物損傷等)引起，逐步導致肝內彌漫性細胞外基質(膠原或非膠原)過度沉積，其核心病理改變過程是肝星狀細胞(Hepaticstellate cells，HSCs)激活并大量增殖，最后轉化成肌纖維細胞樣細胞[1]。在HSCs激活并增殖的過程中，各種致纖維化介質如轉化生長因子β1(transforming growth fatorbata，TGF-β1)會大量分泌，目前認為，在肝纖維化進程中，TGF-β1是最強的致纖維化細胞因子，它有很強的促HSC激活和分泌細胞外基質的作用，與肝纖維化進程密切相關。肝纖維化進展過程中許多細胞外基質非膠原成分如骨橋蛋白(osteopontin，OPN)會增加[2]。大量研究[3]結果表明中醫所述肝臟血瘀程度與肝纖維化程度密切相關，并且具有活血化瘀作用的中藥用于抗肝纖維化治療。

雞矢藤為南藥，在中國瓊海等地廣泛分布，有祛風利濕、消食化積、止咳、活血止痛之效，也是瓊海一帶最有名的小吃食料之一。據現代研究[4-5]表明雞矢藤可以抑制肝臟P4503A氧化酶活性，增加谷胱甘肽含量，降低轉氨酶，可用于黃疸性肝炎等疾病，有利于保護肝臟。本研究擬探討南藥雞矢藤干預大鼠肝纖維化模型中OPN和TGF-β1水平表達的相關性研究。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

Wistar雄性大鼠：30只，體重(150±10) g，清潔級，海南醫學院實驗動物中心。隨機分為正常對照組(10只)、肝纖維化模型非治療組(10只)和肝纖維化模型治療組(10只)。

1.2 主要試劑與藥物

小鼠抗大鼠OPN抗體、羊抗小鼠抗體：北京博奧森生物技術有限公司；

Trizol試劑：純度99%，美國英杰生命技術有限公司；

引物TGF-β1序列(Forward 5’CTTCAATACGTCAGATTCCGCGG3’、Reverse5’GTAACGCCAGGAATTGTTGCTAA3’)、內參照引物(GAPDH)序列(Forward:5’GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT3’Reverse5’GGGGTCATTGATGGCAACA3’)：德國默克公司；

肝纖維化指標測定試劑：武漢博士德生物工程有限公司；

雞矢藤顆粒劑：廣州一方藥業公司。

1.3 主要儀器設備

放射免疫分析儀：CN202M/KZ4GC-911型，北京中西遠大科技有限公司；

低溫冷凍離心機：GTR10-1型，北京鼎盛榮和科技有限公司；

電動玻璃勻漿機：DY89-II型，寧波新芝生物科技有限公司；

臺式水浴恒溫振蕩器：SHA-C型，上海博迅實業有限公司；

干濕恒溫孵育器：MSC100型，寧波立誠科創儀器有限公司；

垂直電泳系統：Bio-Rad型，寧波新芝生物科技有限公司；

酶標儀：ELX-800型，寧波新芝生物科技有限公司。

1.4 造模及給藥

肝纖維化模型非治療組和肝纖維化模型治療組大鼠在3周造模期間，每周3 d腹腔注射0.5%二甲基亞硝胺1次(0.2 mL/100 g)，穩定1周觀察。肝纖維化模型治療組隨后4周予以雞矢藤顆粒劑10 mg/kg灌胃(溶于注射用水中)，正常組與肝纖維化模型非治療組予5 mL/(kg·d)劑量的注射用水灌胃。試驗8周后處死大鼠，以3%水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，留取血標本。肝臟經生理鹽水充分灌洗后稱重，部分組織以4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋，制成4 μm厚切片，其他組織液氮保存備用。

1.5 觀測指標及方法

1.5.1 肝纖維化指標測定 血清透明質酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原肽(PCIII)、Ⅳ型膠原(CIV)采取放射免疫法[2]完成。

1.5.2 OPN蛋白表達 用Westernblot方法檢測，取100 mg 肝組織加4 ℃勻漿緩沖液，于5 000 r/min勻漿60 s，提取肝組織蛋白，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，提取肝組織總蛋白。取50 μg肝臟組織總蛋白，變性后進行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白轉移至硝酸纖維素膜，經5%脫脂奶粉封閉后，用小鼠抗大鼠OPN抗體1∶5 000稀釋。4 ℃孵育過夜，搖床洗滌3次后，以辣根過氧化物標記的羊抗小鼠IgG-HRP 1∶5 000稀釋后，室溫振蕩孵育2 h，倒掉二抗孵育液后以足量緩沖鹽溶液洗滌3次，每次10 min，暗室內ECL-Plus連續3次顯影曝光。以GAPDH為內參照，結果以圖像灰度值比值對照分析。

1.5.3 TGF-β1 mRNA表達的檢測 采用熒光實時定量法[6]。使用TRIzol試劑對肝組織總RNA進行抽提，取1 μg RNA逆轉錄，再取2 μL逆轉錄產物進行PCR擴增。PCR反應條件為：50 ℃起始2 min，93 ℃預變性2 min，93 ℃變性1 min，60 ℃變性1 min和72 ℃變性1 min，延伸40個循環。以GAPDH為內參照，進行TGF-β1 mRNA表達相對定量分析。

1.6 統計學方法

2 結果及分析

2.1 雞矢藤顆粒劑對肝纖維化指標的影響

由表1可知，采用雞矢藤顆粒劑治療組(模型治療組)的抗肝纖維化療效理想，數據與正常組相比有顯著差異(P<0.01)，同時與模型非治療組相比有差異(P<0.05)。模型非治療組的肝纖維化水平最高，各項纖維化的數據與治療組相比有顯著差異(P<0.01)。總體說明雞矢藤顆粒劑延緩了肝纖維化進程。

表1 各組大鼠血清HA、LN、PCIII、CIV數值水平比較?Table 1 Comparison of serum HA, LN, PCIII and CIV in rats of each group (n=10) ng/mL

? *表示正常組的各項指標與模型非治療組和模型治療組相比有顯著差異(P<0.01)；△表示模型非治療組的各項指標與模型治療組相比有差異(P<0.05)。

2.2 雞矢藤顆粒劑對OPN蛋白表達的影響

由表2可知，采用雞矢藤治療(模型治療組)后，可以明顯抑制OPN蛋白表達，其數值水平較正常組有差異(t=2.236，P<0.05)，同時較模型非治療組有顯著差異(t=1.024，P<0.01)。OPN蛋白表達顯影曝光圖見圖1。

表2 各組OPN蛋白表達數值水平比較?Table 2 Comparison of OPN protein expression levels in each group (n=10)

? *表示模型非治療組的各項指標與正常組和模型治療組相比有顯著差異(t=1.024，P<0.01)；△模型治療組的各項指標與模型治療組相比有差異(t=2.236，P<0.05)。

圖1 OPN蛋白表達顯影曝光圖Figure 1 Development exposure of OPN protein expression

2.3 各組TGF-β1 mRNA表達數值水平的比較

由表3可知，采用雞矢藤治療(模型治療組)后，可以明顯抑制TGF-β1 mRNA的表達，其數值水平較正常組有差異(t=2.245，P<0.05)，同時較模型非治療組有顯著差異(t=1.142，P<0.01)。

3 結論

近年來，OPN作為細胞外基質的非膠原糖蛋白組分，在肝纖維化過程中的作用受到研究者的重視[7-11]。OPN可能成為與肝纖維化相關的一個重要的生物標志物。編碼人的OPN基因位于第4號染色體q13上，為一單拷貝基因，長度約為5.4～8.2 kb，人OPN(humanOPN，hOPN)和鼠類OPN(mouseOPN，mOPN)具有59%的同源性。OPN是細胞外基質重要組成部分，含有特異的精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，該序列是OPN發揮多種功能的結構基礎，可通過整合素(integrin)信號通路激活細胞內特異性信號轉導系統調節細胞增殖。OPN等細胞外基質成分黏附于細胞表面的整合素后，引起整合素聚集、黏著斑形成、黏著斑激酶酪氨酸磷酸化、RAS活化，進而刺激有絲分裂素激活蛋白激酶類級聯反應，調節基因表達。如前所述在肝纖維化進程中，TGF-β1有很強的促HSC激活和分泌細胞外基質的作用，與肝纖維化進程密切相關。

表3 各組TGF-β1 mRNA表達數值水平比較?Table 3 Comparison of TGF-β1 mRNA expression levels in each group(n=10)

? *表示模型非治療組的指標與模型治療組相比有顯著差異(t=1.142，P<0.01)；△模型治療組的指標與正常組相比有差異(t=2.245，P<0.05)。

本研究證實雞矢藤顆粒劑可以抑制OPN和TGF-β1 mRNA表達。考慮作用機制為降低整合素信號通路的有效性，因此未激活蛋白激酶類級聯反應，同時間接地抑制了TGF-β1mRNA的表達，HSC激活數量不足，減少了分泌細胞外基質的作用，減緩了肝纖維化的進程。表明OPN與TGF-β1調控的信號通路具有相關性，具體信號通路的調控有待進一步研究。