嬰幼兒配方米粉克羅諾桿菌污染調查與分析

梁安莉，農珍妮，楊江夏，黃 彥

(1廣西民族大學相思湖學院，南寧 530008；2青島大學醫學部，山東青島 266071；3廣西疾病預防控制中心，南寧 530028)

目前認為克羅諾桿菌屬包括7個種：阪崎克羅桿菌、丙二酸鹽克羅諾桿菌、尤尼沃思克羅諾桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、莫金斯克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌和康帝蒙提克羅諾桿菌[1-6]。克羅諾桿菌屬對環境耐受，不同種間具有不同的毒力特性[7]，是一種條件致病菌。臨床病例和分子生物學鑒定發現，C.sakazakii具有更強致病力。6月齡以下的嬰幼兒和60歲以上的成人易感，其臨床癥狀主要為致命性的壞死性結腸炎、腦膜炎、敗血癥等。6月齡以下的早產兒感染該菌的死亡率高達40%～80%[8-10]。世界衛生組織和多個國家已將其列為引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌，要求在嬰兒配方奶粉中不得檢出[11-12]。我國高度重視克羅諾桿菌污染情況的監控，將其列入食源性致病菌的監測范圍[7]。據報道，嬰兒配方奶粉的克羅諾桿菌污染被認為是引起嬰兒發病的主要原因[13-14]。此外，各種母乳替代用品也是克羅諾桿菌污染源之一[15-17]。目前，市售的嬰幼兒米粉為了增加營養常加入一些營養添加成分，而蔬果、淮山、乳粉等原料均是克羅諾桿菌污染來源[18]，增加了感染的風險。為了了解目前市售嬰幼兒配方米粉受克羅諾桿菌的污染情況，及不同添加營養成分與污染是否具有相關性，本研究對廣西區市售不同配方的嬰幼兒米粉受克羅諾桿菌種屬污染的情況進行調查鑒定。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

在廣西區內超市購買不同品牌、不同批次嬰幼兒米粉共125份，其中純營養米粉25份(未添加其他配料原料的)、添加淮山(淮蓮)粉的46份、添加蔬果粉的20份、添加高蛋白乳粉的34份。

1.2 克羅諾菌分離培養

按照2007年Iversen的方法進行菌株的分離培養[19]，無菌稱取100 g樣品，充分溶于900 mL 緩沖蛋白胨水(北京路橋)的三角瓶中，置于37℃ 培養18 h，移取1mL的增菌培養物轉種至10 mL 萬古霉素改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(北京路橋)，44℃培養24 h后，在阪崎腸桿菌顯色培養基(青島海博)上劃線轉種，37℃培養24 h。挑取顯色培養基中的藍綠色菌疑似菌落進行下一步純化鑒定。

1.3 克羅諾菌屬鑒定

純化后的疑似菌株用VITEK 2 compact 生化鑒定儀 (bioMèrieix，法國)進行克羅諾菌屬鑒定，對照菌株阪崎克羅諾桿菌ATCC 25944 購自美國標準菌株庫。

1.4 fusA基因測序

用DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)提取細菌基因組DNA。fusA基因擴增參照Baldwin方法進行[20]，引物fusA-F：5’-GAAACCGTATGGCGTCAG-3’和fusA-R：5’-AGAACCGAAGTGCAGACG-3’，PCR 用擴增試劑盒(Qiagen，US)，反應體系為 50 μL：10μL Q solution、4 μL模板 (5～10 ng/μL)、2 μL的fusA-F引物(10 μmol/L)、2 μL的fusA-R引物(10 μmol/L)、5 μL 10×PCR緩沖液 (含15 mmol /L MgCl2)、1 μL dNTP Mix 溶液 (每種10 mmol /L)、0.25 μL Taq聚合酶(5 U)和25.75 μL去離子水。擴增條件：95℃ 預變性 3 min、95℃ 變性 1 min、58℃ 退火 1 min、72℃ 延伸 2 min，循環 30 次；最后 72℃ 延伸 5 min。PCR 產物用 1% 瓊脂糖電泳，電泳條件電泳條件為 1 × TAE 電泳緩沖液，電壓40 V/cm，電泳 2 h，在紫外光下切膠回收，送生工生物(上海)有限公司雙向測序。

1.5 細菌種類鑒定和進化樹構建

獲得的fusA基因序列在多位點序列分型(MLST)數據庫中 http：//pubmlst.org/cronobacter/info/protocol.shtml 進行種類鑒定和等位基因序列的查找，并用Mega 7 最大似然算法構建進化樹。

2 結果和分析

2.1 感染情況

經增菌培養、顯色培養基分離、克羅諾菌屬鑒定，20株米粉樣品確定為克羅諾桿菌屬，總污染率為16.00%，其中淮山(淮蓮)營養配方米粉污染率最高，為26.09%，其他添加配方的營養米粉污染率均比未添加的營養米粉的高(附表)。

2.2 菌株鑒定和進化分析

通過fusA基因序列在MLST數據庫中比對鑒定，20株陽性菌包含4個不同種克羅諾桿菌，其中C.sakazakii14株、C.malonaticus3株、C.dublinensis2株、C.muytjensii1株。構建的進化樹以克氏檸檬酸桿菌為外群，發現這4種不同的克羅諾桿菌獨立成群(附圖)。本調查表明，在嬰幼兒營養米粉中主要流行的為C.sakazakii，與國內外報道在植物性原材料、食品中致病能力較強的C.sakazakii是克羅諾桿菌屬主要的污染源相一致[5.20-22]。

附表 不同配方米粉克羅諾桿菌感染情況

附圖 米粉中分離的20株克羅諾桿菌的進化分析

3 討論

本調查發現，廣西區內DRP受克羅諾桿菌污染較為嚴重，且添加營養成分的嬰幼兒米粉污染率比單純的營養米粉要高：添加果蔬的配方米粉的污染率約為單純的營養米粉的2倍，添加淮山、淮蓮粉的配方米粉的污染率約為單純的營養米粉的3倍。分析其主要原因為：(1)可能與添加的植物性營養成分本身是克羅諾桿菌的重要來源[23-28]有關。已有研究者通過實驗證實了克羅諾桿菌能存在于25℃采摘的新鮮蔬果，并大量繁殖[10]。陳萬義等[29]調查上海102份蔬菜中克羅諾桿菌菌株，確定13份樣品污染，分離率高達13%(13/102)；此外，植物性原料的較高的污染率可能與種植過程、運輸和加工環節有關。(2)可能與嬰幼兒米粉的生產工藝有關。為了更好地保持添加原料中的營養成分，添加成分往往在添加前沒有進行相應的滅菌處理，缺乏相應的添加原料安全合格檢測指標，且目前企業在混合添加的過程中，主要采取預處理-混合添加-微波消毒的工藝方式，而克羅諾桿菌耐干燥、耐高溫，形成生物膜后粘附能力強的特點，該加工工藝有滅菌不徹底的風險[28]。

為了降低克羅諾桿菌對DRP的污染風險，我們建議生產企業從原材料的質量監控、生產工藝、生產、運輸設備、包裝各個環節著手做好監控：(1)嚴把原材料關：對生產原料實行嚴格的質量監控，做好質量安全檢測。(2)優化生產工藝：繼續做好生產流程優化、監控外，上市前進行有效的抽檢；(3)生產企業要制定和嚴格實施清潔、消毒管理制度，對生產設備和運輸設備進行定期、有效的清潔和消毒；(4)嚴格執行國家的食品包裝要求，在產品包裝上，尤其應對沖調方法、喂養注意事項進行說明，建議用高溫(70℃以上)水沖調米粉[16，沖調后盡快喂食。◇