福建省首例人感染H5N6禽流感病例實驗室診斷與病毒序列初步分析

流感病毒屬于正粘病毒科,為分節段的單股負鏈RNA病毒,其基因包括8個節段。甲型流感病毒根據血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的抗原性的不同,可以分為H1-H18和N1-N11［1］。目前發現能感染人的禽流感亞型有:H4N8、H5N1、H5N6、H6N1、H7N2、H7N3、 H7N4、 H7N7、 H7N9、 H9N2、H10N7和H10N8［2-3］,自1996年中國南方省份報道鵝群發生高致病性H5N1禽流感病毒初次暴發以來［4-5］,在東半球其他國家和地區的鳥和禽類中持續傳播著此類高致病性H5亞型禽流感病毒并偶爾感染到人,且H5亞型禽流感病毒隨著時間推移進行了不斷重組和進化,產生了多種分枝和基因型別。自2014年四川省首次報道人感染H5N6禽流感病例以來［6］,截止2018年2月28日,全球累計報告人感染H5N6禽流感病例19例［7］,共計死亡14例,病死率高達73.7%,所有病例均來自中國,呈散發態勢,至今尚未有證據表明具有人傳人的特征。福建省本次發現的人感染H5N6禽流感病例是最新報道事件,該患者來自于流感監測哨點醫院中的流感樣監測病例(ILI),經中國疾病預防控制中心復核確認。進一步認識人感染H5N6禽流感疫情特點,有助于探索科學有序的防控策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源:患者,女,4歲,2017年12月19日發病,最高體溫39.8℃,就診于三明市流感監測哨點醫院。采集上呼吸道咽拭子標本,低溫冷藏送至三明市疾病預防控制中心進行檢測。同時,采集患者家禽圈和相關活禽A市場外環境標本。標本采集獲得患者家屬知情同意。

1.1.2 試劑儀器:病毒RNA提取試劑盒購置于QIAgen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit(批號:52906),熒光定量PCR試劑盒購置于上海之江生物技術有限公司,一步法RT-PCR試劑盒為TaKaRa公司的PrimeScirptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(批號:RR057A)。主要儀器有:ABI7500熒光PCR檢測儀,Bio-Rad PCR儀和電泳儀,Eppendorf高速離心機。

1.1.3 引物:由福建省疾控中心自行設計并提供,見表1。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取:標本以280 μl裂解,按照試劑盒說明書進行核酸提取,終以 50 μl洗脫 RNA,-70℃保存。

1.2.2 熒光定量 PCR:對標本進行流感 A、B、H1N1、H3N2、H7N9、H5N6 和 H9 型別的熒光定量PCR檢測,按試劑盒說明書進行。

1.2.3 病毒分離:標本送至福建省疾病預防控制中心BSL-3實驗室,采用9～11日齡雞胚進行病毒分離。

1.2.4 一步法RT-PCR與測序:按照TaKaRa試劑盒說明書配制50 μl反應體系如下:2×one step buffer(Dye plus)25 μl,PrimeScript one step Enzyme Mix 2 μl,上下游引物各 2 μl(10 μmol/L),病毒RNA 5 μl,RNase Free dH2O 14 μl。 反應條件為:50 ℃ 30 min,94 ℃ 2 min；94℃30 s＼60℃30 s＼72℃90 s,循環35次；72℃ 10 min,4℃保溫。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測鑒定后送鉑尚生物技術(上海)有限公司進行雙向測序。

表1 流感病毒HA和NA基因擴增通用引物Tab.1 Universal primers of HA and NA gene of influenza virus used in RT-PCR

1.2.5 序列拼接與分析:用DNAStar 7.1和MEGA 5.1軟件對序列進行拼接,將病毒基因序列在GenBank中作BLAST比對。從GenBank和GISAID中下載相關HA和NA基因序列,繪制基因進化樹圖。初步分析HA基因切割位點氨基酸基因特征。

2 結果

2.1 熒光定量PCR結果 按時間順序,一共采集5次病例咽拭子標本,前3次咽拭子標本流感A型通用、H5和N6熒光定量PCR檢測均陽性,而B、H1N1、H3N2、H7N9和H9型流感均未檢出；后2次采集的咽拭子標本A型通用、H5和N6項目檢測均陰性,見表2。采集43份外環境相關標本,共計檢出16份H5陽性標本,外環境標本檢測情況詳見表3。2017年12月29日,福建省疾病預防控制中心復核標本為H5N6陽性,2018年1月5日經中國疾病預防控制中心復核和確認,結合病例臨床表現和流行病學調查結果,報告為福建省首例確診人感染H5N6禽流感病例,病毒被命名為:A/Fujian-Sanyuan/21099/2017(H5N6)。

2.2 病毒分離與測序結果 標本經雞胚培養72 h,收獲病毒,采用血凝試驗鑒定病毒滴度為1∶64；提取病毒RNA,經一步法RT-PCR擴增獲得病例標本病毒的HA和NA基因片段,各片段經雙向測序和拼接后,獲得HA和NA基因全長序列(HA:1 704 bp,NA:1 380 bp)。與此同時,還獲得病例家禽圈一份外環境標本HA基因全長序列,病毒被命名為:A/Environment/Fujiansanyuan/08/2017。

2.3 BLAST比對與同源性分析 將HA和NA全長序列輸入NCBI網站的GenBank中進行BLAST比對,發現HA基因序列與A/Cygnus atratus/Hubei/2Z2-O/2016(H5N8)病毒序列同源性最高,達99.6%；NA基因序列與A/chicken/Hubei/ZYSJF16/2016(H5N6)病毒序列同源性最高,達99.0%；可證實該患者感染H5N6流感病毒,見圖1。通過繪制基因進化樹發現,A/Fujian-Sanyuan/21099/2017病毒的HA基因與患者家養禽場所外環境中檢測的一份病毒序列同源性最高,達100%,其序列高度同源于2015—2016年H5N8病毒株,也高度同源于2017年禽間H5N6病毒株；與我國人感染H5N6病毒株序列比較發現和2014年的四川病毒株更接近,處同一分枝中,而與其他地區的人感染H5N6病毒株在不同分枝中。A/Fujian-Sanyuan/21099/2017病毒的NA基因與人感染H5N6的四川病毒株在不同分枝中,而與其他地區的人感染H5N6病毒株同處在一個分枝中。

2.4 切割位點氨基酸分析 通過酶作用HA將被切割為HA1和HA2兩段,本次實驗研究發現A/Fujian-Sanyuan/21099/2017病毒的HA基因切割位點具有多個堿性氨基酸R,氨基酸序列為PLREK RRKR﹡GLF。

3 討論

根據臨床表現、流行病學特征和實驗室檢測可以判定該事件是一起人感染H5N6禽流感病毒疫情,為全球第19例確診病例,系福建省首例確診病例。該患者來自流感監測哨點醫院ILI監測病例,臨床表現為輕癥流感樣癥狀,因患者母親為醫務工作者,在2017年12月19日患者發病的當天即給予了奧司他韋(達菲)進行治療,至12月22日后患者未再出現發熱癥狀,但通過表2可知患者體內帶毒一直持續到12月29日,提示人感染H5N6病毒患者癥狀消失后仍可繼續攜帶病毒一段時間,這段時間仍需隔離病例防止進一步傳播。從既往文獻報道來看［6,8-10］,人感染H5N6病毒患者大多數為重癥病例,且病死率高,他們往往在發病早期忽視就診或就診于鄉村、社區衛生診所,未及時給予抗流感病毒藥物治療,導致病情惡化甚至死亡,本次疫情案件中的患者在第一時間就給予抗流感病毒藥物治療,及時控制了病情的進一步發展,患者很快康復,提示:在有活禽或活禽場所暴露史前提下出現流感樣癥狀的輕癥患者一定要早發現、早診斷、早治療。

表2 病例咽拭子標本流感H5N6亞型熒光定量PCR檢測結果Tab.2 Real-time PCR results of influenza A(H5N6)virus in the throat-swab specimens from the patient

圖1 A/Fujian-Sanyuan/21099/2017病毒HA和NA基因進化樹分析Note:The sequence of the H5N6 virus in our study is marked by▲,and the sequences of H5N6 viruses isolated from the other H5N6 cases in China are marked by●.All viral strains are influenza H5N6 viruses,which are not marked with subtype behind them.Fig.1 Phylogenetic analysis of HA and NA genes from A/Fujian-Sanyuan/21099/2017 virus

表3 病例相關外環境標本檢測結果Tab.3 Detection results of the specimens from patients’surrounding environment

從外環境標本監測和測序發現,三明市活禽交易市場中存在H5亞型禽流感病毒,與此同時在患者家中養禽場所檢測出1份H5亞型禽流感病毒陽性標本,經測序獲得其序列,與患者感染的H5N6病毒HA基因保持100%同源,從生物信息學角度證明患者感染的來源為家禽或養禽的外環境場所。所以,推行集中養殖、集中屠宰、冰鮮上市、減少活禽接觸或活禽環境暴露可以有效地防止人感染禽流感。通過對福建省首例人感染H5N6禽流感病毒HA和NA基因分析發現,HA基因與湖北省天鵝中分離到的H5N8病毒高度同源,而NA也與湖北省雞中分離的H5N6病毒高度同源,與既往報道的人感染H5N6禽流感病毒基因來源存在不同,也提示H5N6病毒在不斷地進化和重組過程(圖1)。在基因進化樹中,A/Fujian-Sanyuan/21099/2017病毒HA基因與2014年四川人感染H5N6病毒株處同一分枝,而NA基因卻處另一分枝,也說明H5N6病毒的表面基因存在重排的情況,我國禽和畜間流感病毒錯綜復雜,還需進一步結合分析病毒的內部基因來明確基因重組的過程,為科學防控奠定基礎。本次研究的A/Fujian-Sanyuan/21099/2017病毒HA基因切割位點具備多個堿性氨基酸R,符合高致病性禽流感特征［11］,與既往人感染H5N6禽流感病毒HA基因切割位點大體一致。

綜上所述,福建省首次發現人感染高致病性H5N6禽流感病例,病毒HA和NA基因存在一定的變異變遷,加上福建地處長三角和珠三角之間,水網發達、候鳥遷徙和禽間流感病毒錯綜復雜等因素,研究人員需密切關注H5N6禽流感病毒基因的分子演化和重組情況,加快研發抗病毒藥物和疫苗,為人感染H5N6禽流感疫情防控奠定基礎。

利益沖突 無