珠海市吸毒人群丙型肝炎病毒分子流行病學研究

李紅霞 魏泉德 周毅

【主題詞】 吸毒人群；丙型肝炎病毒；基因型；系統進化樹；同源性

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬,為有包膜單股正鏈 RNA病毒,其基因組全長約9.4 Kb。依據 HCV基因序列的差異,可將HCV分為6個主要基因型及不同亞型。據世界衛生組織(WHO)統計,全球HCV感染率約為2.8%,約1.85億人感染,每年因HCV感染導致的死亡病例約35萬例［1］。近年來我國丙型肝炎病例的報告人數呈逐年上升趨勢,2013年報告人數達到203 155例,比2003年(21 145例)增長了近十倍(數據來源:中國衛生計生委網站)。吸毒者中抗HCV陽性率達82%［2］。HCV感染可導致慢性丙型肝炎、肝硬化及肝癌的發生［3］。HCV基因型與丙型肝炎病變嚴重程度、干擾素應答等均密切相關［1］,了解HCV基因型,可為感染者的診斷和治療提供重要的依據。本研究將對2015年收集的珠海市吸毒人群HCV感染者血漿HCV進行分子流行病學研究,以了解珠海地區該人群HCV基因特征及同源性分布,為HCV的預防控制、藥物治療和疫苗研究等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 研究對象為2015年珠海市國家哨點監測抗HCV項目的所有吸毒人員,共435例。所有監測人員均采集抗凝全血,分離出的血漿和血細胞分別于-70℃保存備用。

1.2 試劑與儀器 按中國疾病預防控制中心2011年發行的《丙型肝炎病毒實驗室檢測技術規范》(試行)中關于HCV感染疫情報告的檢測流程要求,抗HCV的初篩和復檢試劑分別為麗珠集團有限公司和萬泰生物有限公司生產的Anti-HCV ELISA檢測試劑盒。HCV RNA的提取試劑為QIAamp Viral RNA Mini Kit。HCV RNA檢測擴增試劑為 AB Applied Biosystems Ambion real time RT-PCR Kit。HCV測序產物擴增試劑為 TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AML)。檢測儀器:多功能酶標儀(型號:Spectra Max M2)；實時定量 PCR儀(AB Applied Biosystems 7500 Real Time PCR system)；梯度 PCR儀(德國Biometra)。

1.3 抗HCV檢測 按Anti-HCV ELISA檢測試劑盒說明書操作。OD值＞0.150為陽性。

1.4 HCV RNA的抽提和檢測 按QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書提取HCV RNA,提取的RNA保存于-70℃備用。

根據HCV 5′端非編碼區序列設計引物和探針。上游引物:5′-CGGGAGAGCCATAGTGGT-3′；下游引物:5′-CAAGCACCCTATCAGGCA-3′； 探 針:FAMCAAGGCCTTTCGCGACCCAA-BHQ1。由上海輝睿生物公司合成。HCV RNA檢測按AB Applied Biosystems Ambion real time RT-PCR Kit和AB Applied Biosystems 7500 Real Time PCR system說明書操作。real tim RT-PCR Ct值≤35為陽性。

1.5 擴增HCV NS5B區域部分序列及測序 擴增及測序引物參考文獻報道［4］,由上海輝睿生物公司合成。取HCV RNA real-time RT-PCR陽性血漿樣本擴增HCV測序產物,RT-PCR反應體系按TaKaRa One Step RNA PCR Kit說明書建立。RT-PCR反應條件:45℃ 30 min；95℃ 10 min；94℃ 10 s,50℃15 s,72℃ 45 s,40個循環；72℃ 10 min；4℃。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,條帶單一、清晰的PCR產物送上海輝睿生物公司測序。

1.6 核酸序列系統進化和同源性分析 使用Chromas軟件整理和收集 HCV核酸序列,通過BLAST GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)確定HCV基因型,采用BioEdit軟件比對和修剪序列使所有序列長度一致,運用MEGA 6.06軟件構建系統進化樹。系統進化樹中的參比序列:EU256002.1(1a)、KF589883.1(1a)、HQ639946.1(1b)、AB691953.1(1b)、AB792683.1(3a)、KC84 4044.1(3b)、DQ480522.1(6a)。構建系統進化樹后,各序列與GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)進行比對,確定與進化樹中各序列近源的毒株來源地區。

2 結果

2.1 一般情況 435名吸毒者中,男性391名,女性44名,年齡19～59歲(均數34.78；中位數35),HCV感染率44.37%；男女性吸毒人群的抗HCV和HCV RNA陽性檢出率有顯著差異(見表1)。

2.2 HCV NS5B區部分序列擴增及測序結果 對155份HCV RNA陽性樣品擴增病毒NS5B區部分序列,然后進行瓊脂糖凝膠電泳,real-time RT-PCR Ct值在30～35的樣品部分擴增條帶不清晰或較弱,部分條帶清晰但測序時出現雙峰等不理想結果,故本研究中只選擇了78份進行序列分析。

2.3 HCV基因型及系統進化和同源性分析 通過BLAST GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/),確定78份樣品HCV基因亞型分布為:6a,60.26% (47/78)；3b,15.38% (12/78)；3a,14.10%(11/78)；1b,6.41%(5/78)；1a,3.85%(3/78)見圖1。構建系統進化樹后,各序列與GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)進行同源性比對,圖1顯示,進化樹中6a亞型的Ⅰ支與來源于中國深圳、丹麥的毒株同源性較高,Ⅱ支與中國佛山毒株同源性較高,Ⅲ、Ⅳ支與中國廣州、加拿大毒株同源性較高,Ⅴ支與中國汕尾毒株同源性較高,Ⅵ與中國香港毒株同源性較高；1 a亞型的Ⅰ支與來源于美國田納西洲的毒株同源性較高；1a亞型的Ⅱ支、1b亞型與來源于英國的毒株同源性較高；3a亞型的Ⅰ支與來源于印度的毒株同源性較高,Ⅱ支與中國、英國、尼泊爾的同源性較高；3b亞型毒株與來源于中國和加拿大的毒株同源性較高。

圖1 珠海市吸毒人群HCV NS5B區基因序列系統進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis on the sequences of HCV NS5B region among drug users in Zhuhai

3 討論

從表1可以看出,珠海地區吸毒人群中的男性明顯多于女性,這可能與男女性的職業特點和生活方式等多方面有關；男性吸毒者的HCV感染率明顯高于女性,則可能與男女吸毒人群的吸毒方式有關。珠海地區吸毒人群HCV感染率(44.37%)明顯低于Tao等研究中的吸毒人群抗HCV陽性率(82%)［2］,這一結果可能與不同地區吸毒人群的吸毒習慣有關,也可能與珠海市健康教育促進工作者的努力和戒毒管理部門對吸毒者的管理以及珠海市醫療保障體系對HCV感染者的康復治療有關。

按Simmonds命名法,HCV分為6個基因型和70多個基因亞型。HCV基因型分布有明顯的地域差異性。以往的資料表明［5］,基因1～3型呈全球性分布,基因1型主要在南美洲及北美洲等國家流行；3型主要分布于東南亞國家；4型主要流行于非洲及中東地區；南非以5型和6型為主,其中5型僅在南非地區流行；6型是越南及其周邊地區的主要基因型。我國北方以1b和2a基因型主；南方地區HCV基因型種類較多,以1b型為主,2a、3a、3b及6a型各自占較大比例［5］。

HCV可經靜脈吸毒、輸血、性傳播、垂直傳播、或經破損的皮膚黏膜傳播如手術、紋身、拔牙、共用衛生器具等。我國早期以輸血和血制品傳播為主,在實行血液篩查HCV制度后,此傳播途徑大幅下降。隨著我國吸毒人群增多,經靜脈吸毒感染HCV的比例增大,我國各地區不同人群HCV基因型分布可能發生顯著變化。Peng等［6］2015年報道,湖北省一般人群HCV基因型分布為1b(83%)、2a(13%)、3b(2.3%)、6a(1.1%)、3a(0.6%)；而 Tao［2］等的研究表明,湖北省吸毒人群HCV基因型優勢順序為1b(約 40%)、3b(約 30%)、3a(約 15%)、2a(約9%)、6a(約 5%)、1a(約 1%),這說明同一地區兩種人群HCV基因型分布不同。而珠海地區2015年吸毒人群HCV基因型優勢順序為6a(60.26%)、3b(15.38%)、 3a(14.10%)、 1b(6.41%)、 1a(3.85%),與李宇雄等［7］2009年報道的珠海地區一般人群 HCV基因型分布 1b(60.38%)、3b(16.98%)、6a(15.09%)、2a(7.55%)比較,2015年珠海市吸毒人群中未檢出2a亞型,但出現了1a和3a亞型,且該人群中流行的優勢毒株為6a亞型；與Tao等報道的廣東地區吸毒人群HCV基因型分布3b(約34%)、6a(約 28%)、3a(約 25%)、1b(約10%)、1a(約 2%)、6n(約 1%)相比也明顯不同［2］,說明廣東省不同地市級、不同人群HCV基因型分布也可能不同。

本研究檢出3個HCV基因型共5個HCV基因亞型。從圖1可以看出,與珠海地區吸毒人群6a亞型同源的毒株來源的地區較廣,有深圳、佛山、廣州、汕尾、中國香港、丹麥和加拿大；與1a亞型Ⅰ支同源的為美國田納西洲的毒株；與1a亞型Ⅱ支、1b亞型同源的毒株均來自于英國；與3a亞型Ⅰ支同源的為印度毒株；與3a亞型Ⅱ支同源的有我國、英國和尼泊爾；而與3b亞型同源的為我國、加拿大毒株。結合李宇雄等［7］報道的珠海地區一般人群 HCV基因型特性,可以推測外來吸毒者在珠海地區HCV感染的傳播中有著重要作用。珠海是沿海口岸城市,有優質的投資平臺和豐富的旅游資源,在與國外交流與合作和外地游客來珠海觀光旅游的過程中,將會伴有吸毒者的流動,這增加了HCV在珠海地區傳播的機會,也導致新的HCV基因亞型傳入珠海以及改變珠海的HCV基因型分布,這對珠海地區的HCV感染防治策略提出了嚴峻挑戰。目前,由于HCV基因組的高度異質性,疫苗的研制仍未取得突破性進展。在根據HCV基因型研究精準治療方案的同時,加強HCV感染的健康教育及禁毒宣傳,普及預防知識,控制毒品,加強對吸毒者的管理,關注吸毒用具的使用,以及結合社會職業特點擴大HCV感染篩查范圍,或者借鑒HIV感染的管理模式進行HCV感染的管理,做到早發現、早治療,應該是降低HCV傳播的有效措施。

利益沖突：無