乙型肝炎病毒X蛋白對B7-H6基因的激活作用

鄒勇 楊小安 鄭常龍 潘興飛 徐啟桓

B7-H6又稱NCR3GL1,屬于B7家族,是近年來利用生物信息學、質譜技術等發現的新型共刺激分子。2009年,Brandt等［1-2］率先證實,B7家族成員B7-H6為人類自然殺傷(NK)細胞天然細胞毒受體NKP30的配體,可以選擇性表達在一些腫瘤細胞表面。最近的研究進一步表明,B7-H6不僅僅在腫瘤細胞上表達,在某些炎癥環境中也可以被誘導表達［3］。HBV相關慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者肝組織中B7-H6的表達顯著上調,并且與疾病嚴重程度顯著正相關,表明NKP30/B7H6相互作用在HBV-ACLF NK細胞介導的肝細胞損傷中可能發揮著重要作用［4］。本研究構建了B7-H6基因啟動子熒光素酶報告基因載體,通過不同劑量的pCMVHBx表達質粒轉染HepG2細胞來驗證HBx蛋白可以促進B7-H6蛋白的表達,為進一步研究B7-H6表達的分子調控機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 VeritasTM微孔板發光檢測儀(Turner Biosystems)；Stbl3感受態細胞、HepG2細胞(本室保存)；PrimeSTAR高保真 DNA聚合酶(TaKaRa)；DNA限制性內切酶(Thermo Scientific)；ClonExpressⅡ One Step Cloning Kit連接酶(諾唯贊)；PrimeSTAR Max Premix(2X)(Takara)；柱離心式膠回收試劑盒、DNA抽提純化試劑盒、質粒抽提試劑盒(中美泰和)；Lipofactamine 2000(Invitrogen)；聚合酶鏈反應(PCR)引物(中美泰和)；pGL3-Basic、pRLTK雙熒光素酶報告基因質粒及檢測試劑(Promega)。

1.2 引物設計與合成 根據http://genome.ucsc.edu中B7-H6 mRNA所對應DNA上游長度約3 Kb區域(B7-H6啟動子區)的堿基序列,設計產物為2.2 Kb大小片段的上下游引物,并加入酶切位點。引物合成由中美泰和完成。上游引物:5′-ATTTC TCTATCGATAGGTAC CTGTCTTTGAGTGAATGTCCC-3′,下 游 引 物:5′-CAGTACCGGAATGCCAAGCTTG AGACCTCTGTTGCGTAAAG-3′,下劃線部分引入酶切位點(KpnI和HindⅢ)。

1.3 啟動子區擴增 以人基因組DNA為模板,選用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶,利用PCR技術擴增B7-H6啟動子區。反應條件如下:94℃預變性5 min,94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸70 s共28個循環,72℃終末延伸3 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小符合后,用PCR產物純化試劑盒回收純化。

1.4 熒光素酶報告基因重組質粒的構建 分別以KpnI和HindⅢ雙酶切PCR產物及pGL3-Basic、利用ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit使目的片段與載體相連接。連接產物轉化感受態細胞Stbl310,涂LB平板過夜。挑取單克隆菌株培養,抽提質粒,并以之為模板進行PCR及瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并將重組質粒進行測序。

1.5 細胞轉染 HepG2細胞接種于24孔板,利用Lipofactamine 2000分別將啟動子質粒pGL3-B7-H6、空載體質粒pGL3-Basic、HBV病毒蛋白真核表達質粒(pCMV-HBs、pCMV-HBc和 pCMV-HBx),本課題組已構建及驗證,詳見參考文獻［5］,共轉染HepG2細胞,所有細胞均以pRL-TK作為內參。轉染48 h后裂解細胞進行雙熒光素酶活性測定。每組設3個復孔,實驗重復3次。

1.6 熒光素酶活性測定 參照Promega公司雙熒光素酶報告基因檢測系統(Dual-Luciferase?Reporter Assay System)說明書中推薦用量及流程檢測各組細胞中熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶(Fluc)活性與海腎熒光素酶(Rluc)活性比值作為最終熒光素酶活性。

1.7 Western blot 不同劑量的pCMV-HBx表達質粒(1-4 μg)轉染HepG2細胞,48 h后收獲細胞,并裂解,收集上清,然后通過SDS-PAGE電泳分離等量的蛋白質提取物(30 μg)轉移至PVDF膜中。用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉非特異性結合位點。加入B7-H6兔多克隆抗體(批號:ab138588,Abcam,美國)或Flag-tag兔多克隆抗體標簽抗體(批號:SAB4301135,Sigma,美國),4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜5×5 min,HRP標記的二抗 (1∶5 000)室溫孵育1 h,TBST緩沖液洗膜5×5 min。利用增強化學發光法(ECL)檢測B7-H6蛋白的表達。1.8 統計學方法 利用SPSS 16.0軟件分析數據。數據均采用均數±標準差(ˉx±s)表示,兩組間均數的比較用Student-t檢驗,p＜0.05差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 人B7-H6啟動子區PCR擴增 人B7-H6啟動子的擴增片段在約2.2 Kb條帶處出現明顯的條帶,與目的片段大小相符。

2.2 pGL3-B7-H6啟動子重組質粒鑒定 重組pGL3-B7-H6啟動子質粒用 KpnⅠ＋NcoⅠ酶切鑒定,切出2 170 bp和4 737 bp的條帶,測序結果顯示克隆出的B7-H6基因啟動子片段序列與GenBank中記錄一致。

2.3 pGL3-B7-H6啟動子轉錄活性分析 如圖1所示,pGL3-B7-H6重組質粒與內參質粒pRL-TK共轉染HepG2細胞,熒光素酶活性較轉染空載體pGL3-Basic組明顯增加(5.24±1.25 vs.1.12±0.31,P＝0.005)。pGL3-B7-H6重組質粒與 HBV病毒蛋白真核表達質粒(pCMV-HBs、pCMV-HBc和pCMV-HBx)分別共轉染HepG2細胞,轉染pCMVHBx質粒組的螢光素酶活性與轉染空載體pCMV-tag組相比顯著升高(17.60±3.36 vs.6.73±1.36,P＝0.001),而轉染pCMV-HBs或pCMV-HBc質粒組與轉染空載體pCMV-tag組相比未見明顯升高(8.37±2.20 vs.6.73±1.36,P＝0.452；9.97±2.79 vs.6.73±1.36,P＝0.157),表明HBX蛋白可顯著增強B7-H6基因啟動子轉錄活性。

圖1 HBV病毒蛋白對B7-H6基因的轉錄激活作用Note:＃compared with pGL3-Basic group,P ＜0.05；?compared with pCMV-tag group,p＜0.05Fig.1 Hepatitis B Virus X proteins promote transcription of B7-H6

2.4 pCMV-HBx表達質粒轉染 HepG2細胞后B7-H6蛋白的表達 不同劑量的pCMV-HBx表達質粒(1～4 μg)轉染 HepG2 細胞,Western blot檢測B7-H6蛋白和標簽蛋白Flag-tag的表達水平。如圖2所示,相對于轉染空載體組(pCMV-tag),轉染pCMV-HBx 表達質粒組(1 μg,2 μg 和 4 μg)B7-H6蛋白表達量均顯著增加(P均＜0.05),而且隨著pCMV-HBx質粒轉染量的增加,HepG2細胞中B7-H6蛋白的表達量亦顯著增加(P均＜0.05)。

圖2 pCMV-HBx表達質粒轉染HepG2細胞后B7-H6蛋白的表達A.Representative Western blot analysis of B7-H6 expression；B.The bar graph shows the ratios of B7-H6 protein expression relative to GAPDH(n＝3).compared with other groups,p＜0.05)Fig.2 Expression of B7-H6 protein post transfection with pCMV-HBx plasmid

3 討論

前期本課題組利用小鼠暴發性肝衰竭模型對肝衰竭免疫介導的肝細胞損傷機制進行了深入研究,發現在病毒誘導的小鼠暴發性肝衰竭中,肝臟NK細胞可以通過NK細胞活化性受體-配體識別途徑NKG2D/NKG2DL和死亡受體途徑Fas/FasL殺傷病毒感染的肝細胞,隨后又發現,NK細胞在人類HBV相關慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者肝臟大量募集和顯著活化,外周血NK細胞天然細胞毒受體(NKP30和NKP46)的表達也顯著增強［5］。最近已發表的結果顯示,NK細胞天然毒受體NKP30特異性配體B7-H6在HBV-ACLF患者肝組織中高表達,且B7-H6表達水平與疾病的嚴重程度密切相關。NK細胞可通過NKP30/B7H6識別通路上調IL-32表達而誘導肝細胞的凋亡［4］。為進一步深入研究HBV-ACLF高炎癥狀態下B7-H6應激表達的分子調控機制,本研究構建了人B7-H6啟動子熒光素酶報告基因質粒,利用HBV病毒蛋白(HBs、HBc和HBx)真核表達質粒分別與人B7-H6啟動子熒光素酶報告基因質粒共轉染,發現HBx蛋白可增強B7-H6基因啟動子的轉錄活性,進一步通過Western blot證實,HBx可顯著增強B7-H6蛋白的表達,表明HBx蛋白對B7-H6基因具有顯著的激活效應,在HBV相關慢加急性肝衰竭NK細胞介導的肝細胞損傷中可能發揮重要作用。

HBx蛋白是一種廣譜的轉錄激活因子,在多種細胞因子參與下能激活多種病毒或細胞的基因轉錄調控區,從而參與細胞的凋亡過程,影響細胞分裂周期,DNA損傷修復,以及腫瘤發生與侵襲轉移等多種病理生理過程［6-9］。而且有研究顯示HBx蛋白可通過激活某些宿主細胞基因的表達而誘導肝細胞損傷,HBx蛋白可以通過轉錄因子Egr-2和Egr-3激活HBV感染的肝細胞癌中FasL基因的表達,從而促進肝細胞的凋亡［10］。 Yoo等［11］證實 HBV 病毒蛋白(HBc和HBx)可通過轉錄因子c-Ets-2激活人纖維介素基因(fgl2),導致局部微循環障礙,肝細胞壞死。Han等［12］也證實 HBx蛋白可通過轉錄因子sp1激活人TRAIL基因,增強TRAIL誘導的肝細胞凋亡。推測HBx蛋白也可能通過特定轉錄因子激活B7-H6基因進而激活NKP30/B7-H6信號通路而促進HBV相關慢加急性肝衰竭NK細胞介導的肝細胞損傷,其精確的轉錄調控機制有待進一步深入研究。

總之,本研究證實了HBx蛋白可能增強了B7-H6基因啟動子的轉錄活性并促進了B7-H6蛋白的表達,為揭示HBV相關慢加急性肝衰竭肝細胞損傷的機制提供了新的分子靶點和理論依據。

利益沖突 無