狂犬病疫苗和人狂犬病免疫球蛋白聯合應用早期免疫效果分析

朱澤榮 魯莎 朱政綱 張曼 鄭熠 胡權

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus)引起的急性致死性傳染病,病死率幾乎達100%,我國是狂犬病流行國家［1］。對于狂犬病暴露者,通過狂犬病暴露后預防處置(post-exposure prophylaxis,PEP)可以有效預防狂犬病的發生,但是失敗案例也有報道［2-3］。研究顯示,PEP時不管是否聯合應用被動免疫制劑,患者體內狂犬病病毒中和抗體(rabies virus neutralizing antibody,RVNA)水平都呈現出逐漸增高趨勢,并在第14天時100%達到保護性水平(≥0.5 IU/ml)［4］。 然而,本單位通過實驗室檢測追蹤數例狂犬病Ⅲ級暴露者RVNA水平變化趨勢,發現了一些與已有研究資料不同的現象,即不同狂犬病疫苗接種方案聯合應用人狂犬病免疫球蛋白(human rabies immunoglobulin,HRIG)后,少數案例可立即獲得高濃度RVNA,隨時間變化逐漸降低但一直維持在保護性水平之上,直到14 d后再逐漸升高［5-6］。由于觀察例數并不多,尚不具有代表性,本研究進一步擴大病例數進行觀察,對狂犬病疫苗和HRIG聯合應用早期免疫效果進行比較分析。

1 對象與方法

1.1 觀察對象 研究對象為2014年3月至2015年12月間到武漢市疾病預防控制中心狂犬病門診就診的狂犬病Ⅲ級暴露者,主訴此前無暴露前或暴露后免疫史,在暴露后24 h內接受PEP。研究獲得本單位醫學倫理學委員會批準,所有入選研究對象均簽署知情同意書。

1.2 PEP和血樣采集 使用遼寧成大股份有限公司生產的凍干人用狂犬病純化疫苗(vero細胞)(規格0.5 ml/瓶,批號為 201202056、201404080)和廣東雙林生物制藥有限公司生產的HRIG(規格200 IU/瓶,批號20130815),均在有效期內使用。采用Essen方案 ＋HRIG或者Zagreb方案 ＋HRIG完成PEP。 所有受試者分別在第0、1、7、14、45 天(Day 0、Day 1、Day 7、Day 14、Day 45)靜脈采血5 ml,離心分離血清,-20℃保存備用。

1.3 RVNA檢測 采用快速熒光灶抑制試驗(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)檢測RVNA［7］。主要試劑包括:BSR細胞、狂犬病病毒標準攻擊毒株CVS-11(ATCC VR-959)、狂犬病免疫球蛋白標準品(NIBSC,英國)、熒光標記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體(FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin,FUJIREBIO INC,日本)。

1.4 統計學方法 采用 Excel、SPSS 18.0、GraphPad Prism 7.0軟件進行數據整理、分析、繪圖。p＜0.05的結果被認為有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察對象人口學資料分析 共計44位狂犬病Ⅲ級暴露者納入觀察,年齡跨度15～70歲,平均年齡35.86±15.8歲；男性20例,平均年齡39.30±16.52歲；女性24例,平均年齡40.33±15.60歲；男女間年齡無顯著差異(t＝-0.21,P＝0.8324)。

2.2 血清RVNA水平比較 通過測定RVNA,有5例觀察對象(均為Essen方案＋HRIG)在第0天RVNA滴度高于0.5 IU/ml,其余39例觀察對象RVNA水平見表1。PEP后相同時間點,不同性別、年齡組、接種方案的RVNA幾何平均滴度(geometric mean titer,GMT)差異無統計學意義。

2.3 血清陽轉率（seroconversion rate，SCR）比較通過測定RVNA,有5例觀察對象第0天RVNA滴度高于0.5 IU/ml,其余39例觀察對象SCR見表2。在第14天以后出現觀察對象失訪(Day 14,3例；Day 45,7例)。39例觀察對象 PEP后不同時間,不同性別、年齡組、接種方案間SCR差異無統計學意義。39例觀察對象在PEP后第1天SCR為35.90%；第7天SCR為71.79%,第14天SCR均達到100%。

表1 39名觀察對象暴露后預防處置后第0至45天狂犬病病毒中和抗體水平比較Tab.1 Comparison of rabies virus neatralizing antibody titers of 39 subjects from day 0 to day 45 after post-exposure prophylaxis

表2 39名觀察對象暴露后預防處置后第0至45天血清陽轉率Tab.2 Seroconversion rate(SCR)of 39 subjects from day 0 to day 45 after post-exposure prophylaxis

2.4 個體RVNA滴度時間變化趨勢 5例觀察對象在第0天RVNA滴度高于0.5 IU/ml,其中4例RVNA滴度呈現上升趨勢,有2例表現為第1天至第7天RVNA快速增高,有2例表現為第1至第7天RVNA平緩增高,第7天后快速增高；另1例第0天已有高滴度RVNA,但在第1天快速下降,此后同其他4例觀察對象RVNA滴度變化趨勢一致(圖1)。7例觀察對象在PEP后第1天RVNA滴度急劇上升到很高水平后又快速下降,第7天RVNA降至0.5～2.5 IU/ml,此后第14天、第45天RVNA水平呈現上升趨勢(圖2)。32例觀察對象在PEP后RVNA滴度呈現緩慢上升趨勢,第1天RVNA低于保護水平者25例,這部分觀察對象RVNA曲線上升相對平緩,第7天有14例陽轉,SCR達56%；而第1天RVNA高于保護水平者7例,這部分觀察對象RVNA曲線上升相對陡峭,第14天所有觀察對象SCR達100%(圖3)。

3 討論

圖1 5例第0天狂犬病病毒中和抗體高于保護水平者狂犬病病毒中和抗體動態曲線Fig.1 Dynamic curve of rabies virus neutralizing antibody(RVNA)of 5 cases with higher RVNA than protective level on day 0

圖2 7例第1天狂犬病病毒中和抗體極度增高者狂犬病病毒中和抗體動態曲線Fig.2 Dynamic curve of rabies virus neutralizing antibody(RVNA)of 7 cases with a sharp RVNA increase on day 1

圖3 32例第0天狂犬病病毒中和抗體低于保護水平者狂犬病病毒中和抗體動態曲線Fig.3 Dynamic curve of rabies virus neutralizing antibody(RVNA)of 32 cases with lower RVNA than protective level on day 0

狂犬病Ⅲ級暴露者和免疫功能低下的狂犬病II級暴露者進行PEP時需要聯合使用狂犬病疫苗和HRIG或者馬抗狂犬病血清,國內主要是應用HRIG［3,8］。長期以來,關于聯合使用狂犬病疫苗和HRIG進行PEP后14天內,尤其是7天內的RVNA研究資料極少。本研究關注狂犬病疫苗和HRIG聯合使用后第0、1、7、14、45 天機體的 RVNA 狀態,研究結果顯示機體RVNA動態曲線表現形式多樣,超出傳統免疫學理論能夠解釋的范疇,部分結果不同于已有的研究結果［9］。本研究結果顯示即使PEP聯合使用狂犬病疫苗和HRIG,也無法100%保障在狂犬病疫苗主動免疫產生的RVNA達到保護水平之前確保體內RVNA高于保護水平,這或許可以部分解釋:即使PEP聯合應用狂犬病疫苗和HRIG,也會有免疫失敗案例的出現［2-3］。同時,PEP聯合應用狂犬病疫苗和HRIG能預防絕大多數狂犬病Ⅲ級暴露者發生狂犬病,說明HRIG主要作用是在局部阻斷狂犬病病毒侵入神經系統。本研究豐富和完善了關于PEP狂犬病疫苗和HRIG相互作用的研究,對于解釋部分PEP失敗案例具有現實意義。

狂犬病II級暴露者單獨接種狂犬病疫苗時,機體RVNA水平逐漸升高,首劑接種后第14天100%達到保護水平,隨后第28天或第42天RVNA水平達到峰值［9-10］。本研究44例觀察對象中有32例(72.73%)RVNA動態曲線與單獨接種狂犬病疫苗的RVNA動態曲線趨勢一致,說明對于多數聯合使用狂犬病疫苗和HRIG的狂犬病暴露者,HRIG對狂犬病疫苗的主動免疫沒有干擾。本研究44例觀察對象中有7例(15.91%)RVNA水平在第1天急劇升高,但是到第7天RVNA水平回落到較低水平,隨后的變化趨勢又與占多數的32例RVNA動態曲線趨勢一致,具體機制還有待后續深入研究。本研究44例觀察對象中有5例在第0天RVNA高于保護水平,其中4例后續RVNA變化趨勢與占多數的32例RVNA動態曲線基本一致,但是其中1例在第0天RVNA水平很高,已經完全不能用任何免疫學理論解釋,有待后續深入研究證實。因此,本研究揭示了2類國內外尚未報道的狂犬病疫苗和HRIG聯合應用時少見的RVNA動態曲線,推測可能與HRIG在局部浸潤注射和余量全身注射比例不同是導致不同RVNA動態曲線的原因,為后續研究提供了思路。

狂犬病Ⅱ級暴露者單獨接種狂犬病疫苗時,在不同接種方案中,不同年齡組的SCR和RVNA的GMT在前14天具有一定差異［9-10］。Essen方案中,小于5歲兒童和大于60歲老人在首劑接種后第7天SCR和RVNA的GMT明顯低于其他年齡組［9-10］。Zagreb方案中,不同年齡組的SCR差異不明顯,但是小于5歲的兒童在首劑接種后第7天RVNA的GMT明顯低于其他年齡組［9-10］。本研究不包括小于5歲的兒童,入選者均為成年人,研究顯示不同性別、年齡組、接種方案間在首劑接種后相同時間點SCR和RVNA的GMT差異無統計學意義。由于本研究觀察對象例數較少,后續有待增加觀察對象例數,覆蓋不同年齡組人群,進一步深入研究。

利益沖突:無