Bacillus sp.C62的砷氧化功能及亞砷酸鹽氧化酶活力測定

楊 成，彭兆豐，陳曉明，侯新東

(中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430074)

砷(As)是普遍存在的污染物，來源于天然[1]和不斷增加的人為活動[2]。據(jù)報道，砷污染已成為嚴(yán)重威脅人類健康的問題，越來越多的人深受其害[3]。砷污染除了影響人體的健康外，土壤中砷的累積還會導(dǎo)致作物產(chǎn)量的下降[4]。因此，砷污染的防治已成為當(dāng)前環(huán)境問題的重要議題。目前，砷污染的修復(fù)主要有物理化學(xué)方法和生物方法。在生物方法中，微生物是砷轉(zhuǎn)化和運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵驅(qū)動力[5-7]，其生物轉(zhuǎn)化包括三價砷[As(III)]氧化、五價砷[As(V)]還原以及三價砷甲基化[5]。

由于As(III)的毒性比As(V)更高[5,8]，由砷氧化細(xì)菌介導(dǎo)的As(III)到As(V)的氧化作用可以降低砷的毒性[5]，因此微生物的砷氧化研究對砷污染的自然修復(fù)意義重大。微生物的砷氧化作用是由亞砷酸鹽氧化酶催化的，亞砷酸鹽氧化酶屬于二甲基亞砜還原酶家族，它由兩個異源亞基組成，一個是含有3Fe-4S簇的大亞基，另一個是含有2Fe-2S簇的小亞基[9]。與As(III)的化學(xué)氧化作用相比，其生物氧化作用更高效、經(jīng)濟(jì)[10]。亞砷酸鹽氧化酶催化亞砷酸鹽氧化成砷酸鹽，氧氣作為電子受體被還原[10-11],其化學(xué)反應(yīng)式如下：

(1)

本研究從位于湖南省石門縣雄黃礦區(qū)的高砷土壤中篩選出耐砷菌株C62，該菌株能有效地催化As(III)到As(V)的氧化反應(yīng)，降低環(huán)境中砷的毒性。本次試驗中，首先對菌株C62進(jìn)行了初步的分類鑒定；然后通過分析化學(xué)和分子生物學(xué)手段驗證了菌株C62的砷氧化功能；最后從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取了亞砷酸鹽氧化酶，對酶活力的測定條件進(jìn)行了優(yōu)化[11-16]，并測定了菌株C62粗酶的活力，以為后續(xù)的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)表征以及實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1.1.1 菌株

本試驗所用的耐砷菌株C62，由中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)分子細(xì)胞與地質(zhì)微生物實驗室篩選并提供。

1.1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：2-N-嗎啡啉乙磺酸(MES)、苯基甲磺酰氟(PMSF)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、2，6-二氯酚靛酚鈉 (DCIP)，購自南京奧多福尼生物科技有限公司，均為sigma品牌；細(xì)菌生化鑒定試劑盒購自北京路橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；PCR相關(guān)試劑為TaKaRa系列；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；UV-3200PC分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；AFS-9600原子熒光分光光度計(北京科創(chuàng)海光儀器有限公司)。

1. 2 菌株C62的篩選和分類鑒定

1.2.1 菌株C62的篩選和生理生化特征鑒定

菌株C62的篩選參考Lieutaud等[15]的方法，在CDM(Chemically Defined Medium)培養(yǎng)基[17]中添加5 mmol/L的As(III)。菌株C62的生理生化特征鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]，接觸酶和甲基紅試驗等采用實驗室試劑完成，葡萄糖發(fā)酵和硝酸鹽還原試驗等采用細(xì)菌生化鑒定試劑盒完成。

1.2.2 菌株C62的16S rRNA基因序列同源性分析

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株C62的基因組DNA，作為16S rRNA基因序列擴(kuò)增的模板；擴(kuò)增引物采用通用引物[19]，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)程序為：首先94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30次循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測序。其測序結(jié)果利用Blast程序與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對分析。選取相關(guān)菌種的同源序列，利用軟件MEGA7構(gòu)建菌株C62的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1. 3 菌株C62的砷氧化功能

1.3.1 菌株C62的生長曲線測定

首先取出保存的菌種C62，在固體CDM培養(yǎng)基[17]上劃線進(jìn)行活化；然后挑取單菌落接種于液體CDM培養(yǎng)基中；最后按1%的接種量接種于含5 mmol/L As(III)的CDM培養(yǎng)基中，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min。菌株C62的生長曲線繪制采用比濁法：從0 h開始，每隔4 h取一次樣，一直取到56 h，測量600 nm處的OD600(Optical Density)值，并以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、OD600值為縱坐標(biāo)繪制菌株C62的生長曲線。

1.3.2 菌株C62的砷氧化曲線測定

砷形態(tài)分析采用原子熒光光譜法[20]。首先菌株C62在含5 mmol/L As(III)的CDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從0 h開始，每隔4 h取一次樣，一直取到56 h，將不同時間所取樣品稀釋5 000倍后，分成兩份，一份測總砷含量，一份過supelclean LAC-SAX SPE柱測As(III)含量；然后測出總砷和As(III)的含量，由兩者之差計算出As(V)的含量；最后以時間為橫坐標(biāo)、砷含量為縱坐標(biāo)繪制菌株C62的砷氧化曲線。以不接種微生物的滅菌培養(yǎng)基作為試驗的對照組。

1.3.3 菌株C62亞砷酸鹽氧化酶大亞基(aoxB)基因序列的測定及同源性分析

以菌株C62的基因組DNA作為亞砷酸鹽氧化酶大亞基(aoxB)基因序列擴(kuò)增的模板;擴(kuò)增引物參考Quéméneur等[21]，正向引物為aoxBM1-2F：5′-CCACTTCTGCATCGTGGGNTGYGGNTA-3′；反向引物為aoxBM3-2R：5′-TGTCGTTGCCCCAGATGADNCCYTTYTC-3′。PCR反應(yīng)程序為：首先94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性45s，52℃退火30 s，72℃延伸1.2 min，35次循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，連接到載體pClone007-T上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選單菌落培養(yǎng)，陽性鑒定后送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測序。其測序結(jié)果利用BlastX程序與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對分析。選取相關(guān)菌種的同源蛋白序列，利用軟件MEGA7構(gòu)建菌株C62的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株C62亞砷酸鹽氧化酶(Aro)的提取

菌株C62亞砷酸鹽氧化酶(Aro)的提取參考Anderson等[13]的方法。首先當(dāng)培養(yǎng)基在600 nm處的OD600值達(dá)到0.6時，停止培養(yǎng)，4℃下以5 000×g離心30 min收集菌體，沉淀用緩沖液A (20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mmol/L PMSF、0.6 mmol/L EDTA、0.9% NaCl，pH=8.4) 洗3次；然后按每克濕菌加5 mL提取液(50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L PMSF、0.6 mmol/L EDTA，pH=8.4)進(jìn)行懸浮，并按1 mg/mL的量添加溶菌酶于室溫下孵育30 min；最后添加Mg(CH3COO)2和MgSO4至終濃度分別為20 mmol/L和100 mmol/L以及適量DNase和RNase，并超聲破碎處理15 min，超聲功率為120 W，超聲5 s、停止5 s，4℃下以20 000×g離心30 min，上清液即為菌株C62的粗酶液。

1.5 菌株C62亞砷酸鹽氧化酶(Aro)活力的測定及活性染色

菌株C62亞砷酸鹽氧化酶(Aro)活力的測定參考DCIP法[13]，采用MES緩沖體系。以2,6-二氯酚靛酚鈉(DCIP)作為電子受體，As(III)作為電子供體，PMS作為Aro和DCIP之間傳遞電子的載體；反應(yīng)體系含有50 mmol/L MES、100 μmol/L DCIP、30 μmol/L PMS、2 mmol/L As(III)，pH值為6.0，檢測波長為600 nm；菌株C62粗酶活力的測定從加入As(III) 時開始，每隔30 s記錄一次分光光度計的讀數(shù)，總共監(jiān)測時間為2 min。以不添加As(III)的測量作為試驗的對照組。Aro的活力定義為：25℃時，每分鐘還原1 μmol DCIP為一個酶活力單位。Aro的比活力定義為：每毫克蛋白每分鐘還原DCIP的量，單位為μmol reduced DCIP/(min·mg)，簡寫為μmol DCIP/(min·mg)。蛋白質(zhì)的定量采用Bradford法[22]，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。為了減小測量誤差，所有數(shù)據(jù)測量3次。

Aro的活性還可以用活性染色的方法來檢測；活性染色采用Native-PAGE凝膠[15]，在冰浴條件下進(jìn)行電泳。活性染色步驟如下：首先將凝膠在50 mmol/L MES緩沖液(pH=6.0)中活化15 min，并在含500 μmol/L DCIP的MES緩沖液中避光染色1 h(4℃)；然后用MES緩沖液短暫漂洗凝膠；最后用含2 mmol/L As(III)和30 μmol/L PMS的MES緩沖液浸潤幾分鐘，直到白色條帶開始出現(xiàn)在藍(lán)色背景上[14-15]。

2 結(jié)果與討論

2. 1 菌株C62的分類鑒定

2.1.1 菌株C62的生理生化特征

本研究采用新鮮菌株C62進(jìn)行生理生化特征試驗，其試驗結(jié)果見表1。

表1 菌株C62的生理生化特征試驗結(jié)果

注：“+”表示陽性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)。

由表1可知，菌株C62的接觸酶試驗和甲基紅試驗呈陽性，V-P測定呈陰性，菌株C62可以利用D-葡萄糖和D-甘露醇產(chǎn)酸，可以水解明膠和淀粉，也可以利用硝酸鹽和檸檬酸鹽，但在有溶菌酶的條件下不能生長。

2.1.2 菌株C62的16S rRNA基因序列同源性分析

菌株C62的16S rRNA基因序列的擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 500 bp(見圖1)，測序后先將序列(1 442 bp)提交到GenBank (accession No.MF537214)，然后利用Blast程序與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對分析，再利用軟件MEGA7，采用Neighbour-Joining法(Bootstrap值設(shè)為1 000)構(gòu)建菌株C62的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。

圖1 菌株C62相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of 16S rRNA gene and aoxB gene of strain C62 1-16S rRNA基因;2-aoxB基因;M-DNA marker

由圖2可見，菌株C62與Bacillusoceanisediminisstrain H2(GQ292772)處于進(jìn)化樹的同一分支上，同源性達(dá)到99%，結(jié)合其生理生化特征，初步確定菌株C62屬于芽孢桿菌屬，命名為Bacillussp.C62。

圖2 基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建的菌株C62系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain C62 based on 16S rRNA gene sequences

2. 2 Bacillus sp. C62的砷氧化功能

2.2.1Bacillussp.C62的生長曲線和砷氧化曲線

Bacillussp.C62的生長曲線和砷氧化曲線見圖3。

圖3 Bacillus sp.C62 的生長曲線和砷氧化曲線Fig.3 Growth curve and arsenite oxidation curves of Bacillus.sp.C62

由圖3可見，Bacillussp.C62在30 °C下培養(yǎng)時，經(jīng)過8 h的延滯期后進(jìn)入對數(shù)生長期，在培養(yǎng)30 h左右生物量達(dá)到最大值，之后進(jìn)入平衡期和衰亡期[見圖3 (a)]；原子熒光光譜的測量結(jié)果顯示，Bacillussp.C62在含有0.04%酵母提取物的CDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 h后，可將初始濃度為5 mmol/L的As(III)幾乎完全氧化為As(V)，而滅菌對照組中的As(III)含量則沒有明顯的變化[見圖3 (b)]。

2.2.2Bacillussp.C62aoxB基因的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

aoxB基因編碼亞砷酸鹽氧化酶的大亞基，是一個有意義的分子標(biāo)記，用于研究砷氧化細(xì)菌在環(huán)境中的砷氧化潛力[21]。以提取的Bacillussp.C62基因組DNA為模板，aoxBM1-2F和aoxBM3-2R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在大約500 bp處有一條明亮的主帶(見圖1)，測序后先將序列提交到GenBank (accession No.MG545913)，再通過BlastX檢索分析，從數(shù)據(jù)庫中選取相關(guān)蛋白序列，運(yùn)用軟件 MEGA7，采用Neighbour-Joining法(BootStrap值設(shè)為1 000)構(gòu)建Bacillussp.C62的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。Bacillussp.C62aoxB基因序列的長度只有

圖4 基于亞砷酸鹽氧化酶基因序列構(gòu)建的Bacillus sp.C62的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bacillus sp.C62 based on protein sequence deduced from arsenite oxidase gene

Quéméneur等[21]所報道的一半，與其他菌株亞砷酸鹽氧化酶的同源性最高為36%，這可能是因為Bacillussp.C62亞砷酸鹽氧化酶的基因比較特殊，也可能是因為aoxB基因在不同的門中保守性不一致[21]，Bacillussp.C62屬于厚壁菌門，而其他菌株大多屬于變形菌門，詳細(xì)的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

2.2.3Bacillussp.C62亞砷酸鹽氧化酶(Aro)的活性染色

Bacillussp. C62菌體總蛋白(每個膠孔約50 μg)組分的Native-PAGE凝膠電泳和活性染色結(jié)果見圖5。

圖5 Bacillus sp.C62菌體總蛋白組分的Native-PAGE凝膠電泳和活性染色Fig.5 Native-PAGE and activity staining of total protein fractions of Bacillus sp.C61、2-培養(yǎng)基中不含As(III)；3、4-培養(yǎng)基中含有5 mmol/L As(III)

由圖5可見，當(dāng)Bacillussp.C62在不含As(III)的條件下培養(yǎng)時，沒有表現(xiàn)出亞砷酸鹽氧化酶活性(膠孔1、2)，而當(dāng)Bacillussp.C62在含As(III)的條件下培養(yǎng)時，就會表現(xiàn)出亞砷酸鹽氧化酶活性(膠孔3、4)，說明Bacillussp.C62亞砷酸鹽氧化酶基因的表達(dá)需要As(III)的誘導(dǎo)。這個結(jié)果與Alcaligenesfaecalis[11]和Ralstoniasp.22[12]的類似。然而，研究報道中還有一些菌種可以不需要As(III)的誘導(dǎo)也能表達(dá)亞砷酸鹽氧化酶活性，但是與在有As(III)條件下生長的細(xì)胞相比，其氧化活力較低[15，23]。

2.3 Bacillus sp.C62亞砷酸鹽氧化酶(Aro)活力的測定

2.3.1 亞砷酸鹽氧化酶活力測定條件的優(yōu)化

由于菌種來源不同，Aro活力的測定條件也有所差異[11-16]，因此本試驗優(yōu)化了一系列的試驗參數(shù)，以滿足Aro活力測定的準(zhǔn)確度和精確度要求。

本試驗使用UV-3200PC分光光度計掃描DCIP的吸收光譜(400～800 nm)，得到不同pH值和緩沖容量下DCIP的紫外吸收光譜,見圖6。

圖6 不同pH值和緩沖容量下DCIP的紫外吸收光譜Fig.6 UV absorption spectra of DCIP at different pH and different concentrations of MES

由圖6可見，DCIP (100 μmol/L)的最大吸收峰在600 nm處[見圖6 (a)、(b)]；MES緩沖液的pH值會顯著影響DCIP的吸光度[見圖6 (a)，MES濃度為50 mmol/L]；而在給定的pH值下，MES緩沖液的緩沖容量(MES濃度為30～70 mmol/L) 對DCIP的吸光度幾乎沒有影響[見圖6 (b)，MES緩沖液的pH值為6.0]。

pH值對于Aro活力的測定是一個敏感的因素，它不但影響DCIP的吸光度，還會影響Aro的活力。pH值和緩沖容量對Aro活力的影響見圖7。

由圖7可見，在MES緩沖液的緩沖容量范圍內(nèi)(pH值為5.4～6.6)，當(dāng)pH值為5.8～6.0 時，Aro的活力達(dá)到最大值[見圖7 (a)，MES濃度為50 mmol/L]，考慮到DCIP在pH值為6.0時的吸收峰更窄[見圖6(a)]，靈敏度更高，最適合的pH值最終設(shè)定為6.0。此結(jié)果與先前的部分報道是一致的[13-16]。MES緩沖液的緩沖容量雖然不會影響DCIP的吸光度，但是仍會影響Aro的活力[見圖7(b)]，MES緩沖液的最佳濃度為50 mmol/L(pH值為6.0)。

圖7 pH值和緩沖容量對Aro活力的影響Fig.7 Effects of pH and concentration of MES on the activity of Aro

DCIP摩爾吸光系數(shù)的測定以及DCIP濃度、溫度和As(III)濃度對Aro活力的影響見圖8。

圖8 DCIP摩爾吸光系數(shù)的測定以及DCIP濃度、溫度和As(III)濃度對Aro 活力的影響Fig.8 Determination of the molar absorbance coefficient of DCIP and effects of DCIP concentration, and As(III) temperature on the activity of Aro

由圖8可見，DCIP在600 nm處的吸光度與DCIP的濃度存在線性關(guān)系[R2= 0.991 1，見圖8(a)]，其線性方程的斜率即為DCIP的摩爾吸光系數(shù)[6 503.5 L/(mol·cm)]；同時DCIP的濃度也會影響Aro的活力，在本試驗中，當(dāng)DCIP的濃度為100 μmol/L時，Aro的活力開始接近最大值[見圖8(b)]；Bacillussp.C62酶活力測定的最適溫度為30℃，而在25℃時其活力已可達(dá)最大值的80%[見圖8(c)]，這表明可以在沒有溫度控制器的室溫條件下檢測Aro活力；As(III)是反應(yīng)的底物，當(dāng)其濃度達(dá)到2 mmol/L時，粗酶活力趨近于最大值[見圖8(d)]。

連續(xù)監(jiān)測法測定的是酶促反應(yīng)的初速率，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)速率會逐漸降低，本試驗采用的監(jiān)測時間為2 min。在Aro和DCIP之間作為電子載體的PMS，在PMS濃度較低(10～30 μmol/L)時只是起到電子傳遞的作用，不會增強(qiáng)反應(yīng)[13]；但當(dāng)PMS濃度超過80 μmol/L 時，會對Aro的活力測定造成嚴(yán)重的干擾(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，本試驗中所使用的PMS濃度為30 μmol/L。

綜上所述，對于Bacillussp.C62，優(yōu)化后的Aro活力測定條件如下：反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)體系中含有50 mmol/L MES、100 μmol/L DCIP、2 mmol/L As(III)和30 μmol/L PMS。

2.3.2 亞砷酸鹽氧化酶(Aro)活力測定條件和粗酶活力的比較

不同菌種亞砷酸鹽氧化酶(Aro)活力的測定條件和粗酶活力(V)的比較見表2。

表2 不同菌種亞砷酸鹽氧化酶(Aro)活力測定條件和粗酶活力的比較

注：MES、As(III)的濃度單位為mmol/L;DCIP、PMS的濃度單位為μmol/L;pH值無單位；粗酶活力V的單位為μmol DCIP/(min·mg)

由表2可見，Aro活力的測定條件因菌種而各異，不同菌種的Aro在反應(yīng)中對底物As(III)表現(xiàn)出不同的親和力；采用優(yōu)化后的條件，測得Bacillussp.C62粗酶的活力為0.015 μmol DCIP/(min·mg)，與其他幾種Aro的活力接近，但顯著低于HydrogenophagaNT-14和Polaromonassp.str.GM1，而GM1是已報道的砷氧化細(xì)菌中Aro活力最強(qiáng)的。

3 結(jié) 論

根據(jù)菌株C62的生理生化特征和16S rRNA序列基因分析，初步確定其為一株芽孢桿菌，命名為Bacillussp.C62；砷形態(tài)分析和aoxB基因的分子檢測表明，Bacillussp.C62具有砷氧化功能，是一株砷氧化細(xì)菌，可在28 h內(nèi)將培養(yǎng)基中的5 mmol/L As(III)幾乎全部氧化成As(V)。采用優(yōu)化后的測定條件，測得Bacillussp.C62的粗酶活力為0.015 μmol DCIP/(min·mg)，可為后續(xù)的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)表征以及微生物對砷污染環(huán)境的修復(fù)奠定理論基礎(chǔ)。