超高效液相色譜-串聯質譜法檢測雞肉中6種大環內酯類藥物殘留量

羅 燕

（深圳市農產品質量安全檢驗檢測中心，廣東 深圳 518005）

大環內酯類（MALs）屬中譜抗生素，是一類具有12～22個碳內酯環的抗生素類群，以1個大環內酯為母核，通過糖苷鍵與1～3分子糖相連接，對革蘭氏陽性菌和支原體具有較強的抗菌活性，臨床上主要用于治療敏感菌引起的呼吸道、消化道和泌尿生殖系統感染，在低劑量下具有良好的促生長作用[1-2]。MALs產生治療作用的同時也存在毒副作用，如果殘留超標，這些動物源性食品流入餐桌后會對人體健康造成損害，具有肝、腎毒性[3]。我國2002年農業部公告第235號及2005年農業部公告第560號規定了紅霉素、替米考星等部分大環內酯類藥物在動物組織中的最大殘留限量值，其中紅霉素在動物組織中的最大殘留限量（MRL）為 200 μg·kg-1；林可霉素在動物組織中MRL為100 μg·kg-1；替米考星在動物組織中MRL為100 μg·kg-1。

近年來國內外對大環內酯類抗生素的研究都有明顯上升趨勢，但我國對于大環內酯的殘留檢測研究較少，因此需要進一步加大對食品中大環內酯類藥物的殘留檢測以保證食品安全[4-5]。目前，MALs殘留檢測方法主要有微生物法、免疫法（ELISA）、薄層色譜法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜串聯質譜法等[6]。

本試驗采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS），建立了雞肉中大環內酯類抗生素紅霉素、替米考星、泰樂菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素簡便、快速、高效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取新鮮雞胸及雞腿雞肉，充分絞碎，勻質，-20℃避光保存。

1.2 儀器設備

AB Sciex Triple QuadTM 4500質譜儀、NEVAP-24型全自動氮吹儀、IKA旋渦混合器、梅特勒PL602E型天平、Sigma 3-30KS離心機、Milli-Q Integral 3型超純水儀、奧特賽斯AS系列超聲波清洗機、Oasis PRiME HLB（6cc，200 mg）固相萃取柱。

1.3 主要試劑與標準物質

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）；乙腈水溶液：80%乙腈水+0.2%甲酸。標準物質：紅霉素、替米考星、泰樂菌素、林可霉素、螺旋霉素和羅紅霉素均來自德國Dr.Ehrenstorfer；吉他霉素來自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 標準溶液的配置

準確稱取紅霉素、替米考星、泰樂菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素、羅紅霉素的標準品，用甲醇分別配成約1.00 mg·mL-1的標準儲備液，-18℃保存。

1.5 試驗方法

稱取試樣2.5 g，精確到0.01 g，加入適量內標工作液（羅紅霉素），置于50 mL離心管中，加乙腈水溶液（80%乙腈水+0.2%甲酸）10 mL，漩渦混勻1 min，超聲5 min，高速冷凍離心機9 000 r·min-1離心5 min。

移取3.5 mL上清液，直接過6 cc規格PRIME HLB固相萃取柱（6 cc，200 mg），保持1 s·滴-1的速度，收集濾液。準確移出2.5 mL濾液至15 mL帶刻度小管內，在40℃水浴下氮氣吹至＜0.5 mL。殘留液用甲醇+水+甲酸（10∶90∶0.09）溶液定容至1.00 mL，過0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯質譜測定。

1.6 儀器條件

1.6.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相A相為0.1%甲酸水溶液；流動相B相為甲醇溶液；柱溫位40℃；進樣量5.0 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.6.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測（MRM）；電離電壓：3.2 kV；源溫：110℃；霧化溫度：350℃；錐孔氣流速：50 L·h-1；霧化氣流速：650 L·h-1。

MALs抗生素質譜參數見表2。

空白基質及添加藥物樣本。紅霉素、替米考星、泰樂菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素色譜圖見圖1～6。

表2 MALs抗生素質譜參數

圖1 空白基質添加15.0 μg·kg-1紅霉素

圖2 空白基質添加15.0 μg·kg-1替米考星

圖3 空白基質添加15.0 μg·kg-1泰樂菌素

圖4 空白基質添加15.0 μg·kg-1林可霉素

圖5 空白基質添加15.0 μg·kg-1吉他霉素

圖6 空白基質添加15.0 μg·kg-1螺旋霉素

2 結果與討論

2.1 標準曲線

稱取5個陰性樣品經過上述試驗方法處理獲得樣品空白提取液。用樣品空白提取液配制混合外標濃度為1.00、2.00、5.00、10.0、50.0 μg·L-1系列標準曲線，供液相色譜串聯質譜測定。

紅霉素、替米考星、泰樂菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素基質試驗的線性范圍在1.00～50.0 μg·L-1內，峰面積與相應回收濃度呈現良好的線性關系，其相關系數分別為r=0.999 05、r=0.999 67、r=0.999 85、r=0.999 91、r=0.999 02、r=0.999 85。

2.2 方法檢出限確定

以空白雞肉樣本為基質，添加濃度為3.00μg·kg-1，按照上述方法全過程進行預處理和測定，平行樣本n=6，根據各樣本檢測值計算出平均值X及標準偏差 Sb，再根據公式檢出限（MDL）=（k×Sb×C）/X（其中：k為置信因子，一般取3），計算出紅霉素、替米考星、泰樂菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素檢出限分別為0.19、0.90、0.83、0.69、0.84、0.56 μg·kg-1，均低于標準方法檢出限1.0 μg·kg-1，能滿足實驗要求。

2.3 回收率測定

用空白基質樣品進行 3.00、6.00、30.0 μg·kg-13個水平的添加回收實驗，每個水平取6個平行樣，按上述試驗方法進行處理，供液相色譜串聯質譜測定。其平均回收率和相對標準偏差結果見表3。

表3 加標樣品回收率及相對標準偏差

由表3可知，本試驗對雞肉中紅霉素、替米考星、泰樂菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素的提取穩定，受到基質的干擾較小。

3 討論與結論

本試驗采用內標法對檢測物質進行定量，通過測量內標物（即校正因子）及預測組分的峰面積的相對值來進行計算，在一定程度上消除了前處理操作及環境、儀器條件等的變化所引起的誤差，具有較好的精密度和準確度。本試驗建立的雞肉中紅霉素、替米考星、泰樂菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素超高效液相色譜-串聯質譜的測定方法通過回收率和多種食品樣本的實測試驗證明：上述方法樣本前處理方法簡便、快捷、易操作，液相色譜串聯質譜的條件設置合理，相關參數優化較佳，靈敏度較高，可準確進行定性、定量檢測，適用于可食動物肌肉紅霉素、替米考星、泰樂菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素殘留的檢測。