食用菌中熒光增白劑高效液相色譜檢測方法研究

雷欣宇　付成平　仲伶俐　李曦　趙珊

摘 要：建立了同時(shí)測定食用菌中3種熒光增白劑（C.I.24，C.I. 210，C.I. 220）含量的高效液相色譜法。樣品前處理采用50% N，N-二甲基甲酰胺-水溶液作提取劑，常溫超聲提取30 min。采用Sepax BR- C18柱為分析柱，以10 mmol·L-1甲酸銨水溶液和甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，熒光激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為435 nm。結(jié)果顯示，3種熒光增白劑在1～200 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性范圍較寬，線性關(guān)系良好；C.I.24檢出限為15 μg·kg-1，定量限為30.0 μg·kg-1，C.I.210和C.I.220檢出限為7.5 μg·kg-1，定量限為15.0 μg·kg-1；3種熒光增白劑不同添加水平的加標(biāo)平均回收率在75.1%～108.1%，RSD在1.2%～14.4%。該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好，能夠適用于食用菌中熒光增白劑的檢測。

關(guān)鍵詞：熒光增白劑；食用菌；高效液相色譜

中圖分類號：O652.63 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.07.002

Study on Determination Method of Fluorescent Whitening Agents in Edible Fungi by HPLC

LEI Xinyu， FU Chengping， ZHONG Lingli， LI Xi， ZHAO Shan

（Analysis and Testing Center， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu， Sichuan 610066， China）

Abstract： A method for the determination of three kinds of fluorescent whitening agents（C.I.24， C.I. 210， C.I. 220）in edible fungi by HPLC was developed. The samples were extracted with 50% N， N-Dimethyl formamide-water solution by ultrasonic for 30 min at room temperature. The HPLC method was performed on a Sepax BR- C18 column， and 10 mmol·L-1 Ammonium formate and methanol were used as mobile phases in the gradient elution. Fluorescence detector was adopted in the excitation wavelength of 350 nm and emission wavelength of 435 nm. The results showed that the correlation coefficient of three kinds of fluorescent whitening agents in the range of concentration of 1 ～ 200 ng·mL-1 were greater than 0.999. The limit of detection of C.I.24 was 15 μg·kg-1， and the limit of quantification was 30.0 μg·kg-1， the limit of detection of C.I.210 and C.I.210 were 7.5 μg·kg-1， and the limit of quantification were 15.0 μg·kg-1. The average recoveries of three kinds of fluorescent whitening agents were in the range of 75.1%～108.1% at different spiked levels， and the RSD were in the range of 1.2%～14.4%. This method was simple， accurate， high sensitive and reproducible， and could be applied to the determination of fluorescent whitening agents in edible fungi.

Key word： fluorescent whitening agents； edible fungi； HPLC

熒光增白劑是一種熒光染料，它通過吸收不可見紫外光，再發(fā)射出可見藍(lán)光或藍(lán)紫色熒光，可使被染物品達(dá)到增白增艷的效果，被廣泛應(yīng)用于紡織、紙張、洗滌劑、包裝等制造加工業(yè)[1]。除增白作用外，熒光增白劑還具有一定的防腐保鮮功能，因此市場上有不法商家將其添加到雙孢菇、海鮮菇等白色食用菌中，以使產(chǎn)品色亮好看，貨架期延長。另外，在包裝、運(yùn)輸和銷售過程中，食用菌與包裝材料接觸也可能導(dǎo)致熒光增白劑污染。有報(bào)道稱，熒光增白劑被人體吸收后經(jīng)長期積累會(huì)有致癌風(fēng)險(xiǎn)[2]。雖然現(xiàn)在熒光增白劑對人體的危害問題尚無定論，但基于目前的試驗(yàn)和研究水平，有必要對熒光增白劑的使用進(jìn)行限制和監(jiān)管。

在我國，熒光增白劑被劃分為精細(xì)化工產(chǎn)品，嚴(yán)禁違法添加到農(nóng)產(chǎn)品中。國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)也已明確規(guī)定，食品包裝用原紙、餐具洗滌劑、食品工具設(shè)備用洗滌劑與洗滌消毒劑中均不得檢出熒光性物質(zhì)。為保障消費(fèi)者的健康安全，在加強(qiáng)對食用菌中熒光增白劑污染問題監(jiān)管力度的同時(shí)，研究和制定食用菌中熒光增白劑含量的測定方法有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，有關(guān)食用菌中熒光增白劑檢測方法并無相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)行的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1257—2006只能作定性檢測，不能作定量檢測，在一定程度上限制了食用菌安全監(jiān)管效果。有關(guān)熒光增白劑檢測方法的研究也主要集中在食品包裝材料[3]、紙張[4]、洗滌劑[5]及塑料制品[6]等方面，關(guān)于食用菌的報(bào)道較少。有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，采用離子對試劑進(jìn)行液相檢測，能有效分離檢測3種熒光增白劑，但離子對試劑的使用會(huì)造成色譜柱不可逆的損傷，縮短其使用壽命；另有報(bào)道[8]，采用液質(zhì)聯(lián)用法，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，但該法質(zhì)譜設(shè)備成本高、操作技術(shù)要求高、固相萃取前處理步驟繁瑣，方法推廣有一定的局限性。

針對目前食用菌中熒光增白劑檢測標(biāo)準(zhǔn)不完善及食用菌安全日常監(jiān)管的需要，本文以市場上使用最多的二苯乙烯雙三嗪結(jié)構(gòu)型熒光增白劑為研究對象，前處理采用N，N-二甲基甲酰胺水溶液超聲提取（較固相萃取法簡便快捷，有效減少操作誤差，降低實(shí)驗(yàn)成本），利用高效液相色譜-熒光檢測法進(jìn)行分析，獲得快速、簡便、靈敏度高的檢測方法，旨在為食用菌中違禁添加熒光增白劑行為的監(jiān)管工作提供有力的技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 食用菌 供試食用菌為市售的新鮮雙孢菇、海鮮菇、雞腿菇、白玉菇。

1.1.2 試劑與儀器設(shè)備 甲醇為色譜純，美國Fisher公司；乙腈為色譜純，美國Fisher公司；甲酸銨為色譜純，美國Sigma公司；N，N-二甲基甲酰胺為分析純，西隴化工；氨水為分析純，濃度為25%～28%，西隴化工。熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)品（C.I.24，C.I. 210，C.I. 220）為100 μg·mL-1，福州綠川生物科技有限公司。

Agilent 1200高效液相色譜儀（配置熒光檢測器），美國Agilent公司；AUY220型分析天平，日本島津公司；TDZ5-WS離心機(jī)，長沙湘儀儀器有限公司；QIlinbeier渦旋混勻器， 海門市其林貝爾儀器制造有限公司； KQ5200DE超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.3 高效液相色譜條件 色譜柱為Sepax BR- C18柱（250.0 mm×4.6 mm，粒徑5 μm，pH值適用范圍2～10）；流動(dòng)相A相為10 mmol·L-1甲酸銨水溶液；B相為甲醇；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；激發(fā)波長為350 nm；發(fā)射波長為435 nm；梯度洗脫條件如表1所示。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10 μg·mL-1） 精密移取適量熒光增白劑C.I.24、C.I. 210、C.I. 220標(biāo)準(zhǔn)品，用40%乙腈水溶液分別配制成濃度為10 μg·mL-1的儲(chǔ)備液，避光1～5 ℃保存，有效期90 d。

1.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（C.I.24為2.0 μg·mL-1，C.I.210和C.I.220為1.0 μg·mL-1）分別移取2 mL C.I.24、1 mL C.I.210、1 mL C.I.220的上述3種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用40%乙腈水定容至10 mL，避光1～5 ℃保存，有效期30 d。

1.2.1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 根據(jù)需要吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用40% N，N-二甲基甲酰胺-水溶液稀釋至一定濃度（含C.I.24濃度為2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 ng·mL-1，C.I.210和C.I.220濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0， 50.0，100.0 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液）。避光1～5 ℃保存，有效期7 d。

1.2.2 樣品前處理 稱取5 g試樣勻漿（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入30 mL的 50% N，N-二甲基甲酰胺-水溶液渦旋混勻后，用氨水調(diào)節(jié)pH值至8，超聲30 min，在4 000 r·min-1下離心10 min。取1 mL上清液加0.25 mL水渦旋混勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾至棕色進(jìn)樣瓶，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件的確定

2.1.1 流動(dòng)相的選擇 本試驗(yàn)首先比較了液相中最常用的乙腈-水和甲醇-水2種流動(dòng)相系統(tǒng)對3種熒光增白劑的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其分離效果和色譜峰峰形均不好，由于乙腈洗脫能力更強(qiáng)，目標(biāo)物幾乎無保留。考慮到這3種熒光增白劑均屬于含有磺酸基的二苯乙烯雙三嗪結(jié)構(gòu)的陰離子型化合物，在酸性條件下不穩(wěn)定，容易發(fā)生聚合和析出[8]，試驗(yàn)采用甲酸銨水溶液和甲醇作為流動(dòng)相，考察了不同濃度的緩沖液和不同梯度條件下的分離效果，結(jié)果表明，以10 mmol·L-1甲酸銨水溶液和甲醇作為流動(dòng)相，按表1所述洗脫條件進(jìn)行梯度洗脫可獲得滿意的信號響應(yīng)和分離效果。

2.1.2 色譜柱的選擇 在相同色譜條件下，對比了CLOVERSIL C18 柱和Sepax BR- C18柱的分離效果，結(jié)果表明，二者均有很好的保留。但考慮到試驗(yàn)條件偏堿性，為減小對色譜柱的傷害，延長色譜柱的壽命，試驗(yàn)選用耐堿性更好的Sepax BR- C18柱（250.0 mm×4.6 mm，粒徑5 μm，pH值適用范圍2～10）。3種熒光增白劑混合標(biāo)液的色譜如圖1所示。

2.2 前處理?xiàng)l件的確定

2.2.1 提取溶劑的選擇 在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[9-10]，初步選用乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、四氫呋喃、三氯甲烷作為提取溶劑，選用雙孢菇陰性樣品加標(biāo)進(jìn)行回收試驗(yàn)，結(jié)果表明，N，N-二甲基甲酰胺提取效果最好，其次為二甲亞砜，乙腈、甲醇幾乎無回收，因此，選擇N，N-二甲基甲酰胺作為提取溶劑。進(jìn)一步對提取溶劑的濃度進(jìn)行篩選，分別以20%，40%，50%，80%，100%的N，N-二甲基甲酰胺-水溶液為提取液，比較不同濃度N，N-二甲基甲酰胺溶液的提取效果，結(jié)果如圖2所示。隨著N，N-二甲基甲酰胺濃度的增加，提取回收率呈增加趨勢，當(dāng)濃度達(dá)到50%以上后，回收率基本保持不變，考慮到高濃度的有機(jī)試劑對環(huán)境的污染和對實(shí)驗(yàn)人員健康的不利，在保證提取效果的前提下，選用50%的N，N-二甲基甲酰胺作為提取溶劑。

2.2.2 溶劑效應(yīng)的消除 當(dāng)樣品溶液的溶劑強(qiáng)度強(qiáng)于流動(dòng)相溶劑強(qiáng)度時(shí)，有可能出現(xiàn)目標(biāo)峰展寬、分叉的現(xiàn)象，即溶劑效應(yīng)。本方法中樣品提取溶劑為50%的N，N-二甲基甲酰胺，極性大于初始流動(dòng)相，直接進(jìn)樣檢測后發(fā)現(xiàn)，色譜峰變寬且出現(xiàn)分叉，嚴(yán)重影響了方法的準(zhǔn)確度和靈敏度。為消除溶劑效應(yīng)的影響，采用稀釋樣品溶劑濃度的方法改善峰形。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)N，N-二甲基甲酰胺濃度不大于40%時(shí)，不再出現(xiàn)溶劑效應(yīng)。考慮到過度稀釋樣品液會(huì)降低方法靈敏度，在避免溶劑效應(yīng)的前提下，選擇將樣品上機(jī)液濃度稀釋至40%。

2.2.3 提取液pH值的確定 分別用鹽酸和氨水調(diào)節(jié)提取液pH值至4，6，8，10，以未調(diào)pH值提取液為對照，選用雙孢菇陰性樣品加標(biāo)進(jìn)行回收試驗(yàn)，比較不同pH值提取液對熒光增白劑提取效果的影響，結(jié)果表明（圖3），提取液pH值對回收率有顯著影響，其中，偏酸性提取液和對照組基本無回收；偏堿性提取液回收率顯著增加，當(dāng)提取液pH值為8時(shí)回收率最高。因此，提取液pH值確定為8。

2.2.4 提取液用量的確定 分別考察了不同提取溶劑體積（15，20，25，30，40 mL）對雙孢菇加標(biāo)樣品中3種熒光增白劑的提取效果，結(jié)果表明（圖4），增加提取溶劑體積有助于提升提取效果，當(dāng)提取體積為30，40 mL時(shí)，3種熒光增白劑的回收率均較高，且二者間無顯著差異。為節(jié)省溶劑成本，減少環(huán)境污染，同時(shí)考慮到提取液用量增加會(huì)降低方法靈敏度，故選取提取溶劑體積為30 mL。

2.2.5 提取溫度和提取時(shí)間的確定 將雙孢菇加標(biāo)樣品分別于室溫、40，50，60，70 ℃條件下超聲提取30 min，比較提取溫度對熒光增白劑提取效果的影響，結(jié)果表明（圖5），各個(gè)溫度下熒光增白劑的回收率間無顯著差異，說明提取效果幾乎不受溫度的影響。因此，選擇在常溫條件下提取。將加標(biāo)樣品分別超聲提取15，30，60，120 min，比較超聲時(shí)間對提取效果的影響，結(jié)果表明，回收率在較短時(shí)間段內(nèi)增加明顯，在30 min時(shí)提取回收率最高；隨著提取時(shí)間繼續(xù)延長，提取回收率稍有下降（圖6），故選擇提取時(shí)間為30 min。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法的線性范圍、檢出限與定量限 將系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液由低到高依次進(jìn)樣檢測，以測得峰面積為縱坐標(biāo)，以對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明，熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)工作液在1～200 ng·mL-1范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性范圍較寬，線性關(guān)系良好。根據(jù)信噪比（S/N）>3為檢出限，信噪比（S/N）>10為定量限的原則，再根據(jù)前處理中稀釋倍數(shù)的換算，得出方法檢出限和方法定量限，結(jié)果如表2所示。

2.3.2 方法的回收率與精密度 對雙孢菇、海鮮菇、雞腿菇和白玉菇4種白色食用菌進(jìn)行空白加標(biāo)回收試驗(yàn)。在空白樣品中添加適量熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別制成檢出限、5倍定量限和25倍定量限3個(gè)濃度水平的陽性樣品，每一水平進(jìn)行6次平行測定，平均回收率與精密度如表3所示。由表3可知，3種熒光增白劑不同添加水平的平均回收率在75.1%～108.1%，RSD在1.2%～14.4%，其回收率和精密度均符合方法學(xué)要求，可用于食用菌中熒光增白劑C.I.24、C.I.210、C.I.220的檢測。

2.3.3 空白試驗(yàn) 為確認(rèn)樣品基質(zhì)對目標(biāo)分析物是否存在干擾現(xiàn)象，將食用菌陰性試樣按本方法進(jìn)行測定分析，結(jié)果表明，在目標(biāo)分析物出峰位置沒有其他雜質(zhì)峰出現(xiàn)，即樣品基質(zhì)對所測分析物無干擾，試驗(yàn)方法能滿足檢測要求。圖7、圖8分別為雙孢菇空白樣與加標(biāo)樣的液相色譜結(jié)果。

3 結(jié) 論

本研究采用高效液相色譜-熒光檢測法建立了食用菌中3種熒光增白劑含量的檢測方法。該方法前處理簡便高效，方法線性范圍寬，線性關(guān)系良好，靈敏準(zhǔn)確，精密度高，有效填補(bǔ)了目前食用菌中熒光增白劑檢測標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)空白，為維護(hù)消費(fèi)者的身體健康和保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管工作提供了技術(shù)手段。

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