烏鱧β-肌動蛋白cDNA克隆與表達分析

李 銳, 文正勇*, 覃川杰, 鄒遠超,王 均, 賀 揚, 袁登越

(1. 內江師范學院 生命科學學院， 四川 內江 641100；2. 內江師范學院 長江上游魚類資源保護與利用四川省重點實驗室， 四川 內江 641100)

肌動蛋白(actin)是構成細胞的基本骨架主要成分，廣泛分布于動植物等真核生物細胞中，主要參與細胞的分裂、細胞器運動、染色體運動、細胞激化、mRNA加工和運輸等許多重要生理過程[1-3].肌動蛋白家族包括6種異構體、2種平滑肌型(α-血管平滑肌型和γ-內臟平滑肌型)、2種橫紋肌型(α-骨骼肌型和α-心肌型)和2種細胞質型(β-細胞質型和γ-細胞質型)[4-5].β-actin的氨基酸序列在脊椎動物中十分保守：劉秀霞等[5]報道魚類、兩棲類、鳥類、哺乳類等不同類群脊椎動物β-actin氨基酸序列同源性均在96%以上；覃川杰等[6]報道寬體沙鰍(Sinibotiareevesae)的β-actin氨基酸序列與凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)等無脊椎動物具有較高的同源性，與鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、小白鼠(Musmusculus)等脊椎動物的同源性高達95%～99%，提示該基因的生理功能在不同物種之間具有很高的保守性.此外，β-actin在不同的組織細胞中能較高較穩定地表達，且不容易隨年齡的變化而改變，因此在研究某基因的mRNA相對表達量時，β-actin常常被用作內標基因[7].目前，包括鱖魚(Sinipercachuatsi)[5]、寬體沙鰍[6]、黃鱔(Monopterusalbus)[8]、鳡魚(Elopichthysbambusa)[9]、松江鱸魚(Trachidermusfasciatus)[10]、大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[11]等在內的多種硬骨魚類β-actin基因已經被成功克隆，將為這些魚類功能基因的轉錄調控研究奠定良好的基礎.

烏鱧(Channaargus)隸屬鱸形目(Perciformes)、攀鱸亞目(Anabantoidei)、鱧科(Channidae)鱧屬(Channa)，又叫財魚、烏魚、黑魚、生魚、斑魚等，俗稱烏棒，是一種兇猛的肉食性魚類.烏鱧營養豐富、味道鮮美，一直被認為是食療和滋補的佳品[12].目前我國除新疆、西藏地區外，其他省份各大水系均有分布[13].烏鱧作為我國的大宗水產養殖品種，對我國的國民經濟收入具有較大的貢獻，據2016年中國漁業年鑒統計，2015年我國烏鱧總產量49.5萬t，在大宗淡水養殖魚類中排第9位.同時，烏鱧作為特種水產養殖品種，對四川的漁業經濟也具有重要貢獻：2015年四川省烏鱧產量8 977 t，占全國總產量1.8%，且產量逐年上升.內江地處成渝之間，擁有川南最大的水產養殖水面，水產養殖總產量位居四川前三，同時也是烏鱧主養區之一.隨著生物技術的快速發展，對烏鱧在分子生物學方面的研究越來越多：胃蛋白酶原基因[14]、腦型芳香化酶基因[15]、MHC[16]、STAT1[17]及Foxl2[18]等許多功能基因被克隆，這些功能基因的轉錄水平研究都需要管家基因作為內標，β-actin已廣泛作為內參基因使用，對其進行研究顯得十分重要.本研究首次克隆了烏鱧的β-actin基因的cDNA序列，并對其進行了生物信息學分析，進一步對其組織表達進行了檢測，以期為其他功能基因的研究以及轉基因烏鱧的生產奠定理論基礎.

1 材料與方法

1.1試驗用魚及暫養管理試驗用烏鱧購于內江市桂湖街農貿市場，為人工養殖烏鱧，暫養于內江師范學院長江上游魚類資源保護與利用四川省重點實驗室.烏鱧暫養于100 L水族箱中，水溫(22±0.5) ℃，水體溶氧保持在(7.5±0.6) mg·L-1之間，且每2 d換水族箱中的水約1/3，新換用水均有充分曝氣.每天晚上7點投喂餌料，餌料占體質量比為5%，未吃完餌料及時撈出.

1.2組織樣品獲得經暫養2周后，選取健康無病、活力好的4尾烏鱧用于試驗(其中1尾用于克隆，另3尾用于組織分布)，平均體質量為(150±5.6) g.試驗魚經MS-222麻醉后，置于冰上并迅速取出腦、肝臟、心臟、肌肉、脂肪(腸系膜脂肪)、脾臟、腎臟(中腎)、胃、眼、鰓、性腺共11個組織，樣品立即放入液氮中冷凍，然后放于-80 ℃冰箱備用.

1.3β-actin基因cDNA序列克隆將健康烏鱧解剖后，取適量肝臟組織，利用Trizol法提取總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，用Eppendorf核酸分析儀測定其濃度，并取1 μg總RNA按照TaKaRa反轉錄試劑盒操作說明合成第一鏈cDNA，保存于-80 ℃冰箱備用.

從實驗室測得的烏鱧性腺轉錄組數據庫(未公布)中獲得β-actin的mRNA部分核心序列片段，經NCBI數據庫BLAST比對確認后，結合GenBank已公布的其他魚類β-actin保守序列設計兩對性引物，分別是:

cDNA-F1:5′-CACGCGTAACTCACCTGAAC-3′,

cDNA-R1:5′-GGCATACAGGTCTTTACGG-3′，

cDNA-F2:5′-CCTTCCTTCCTCGGTAT-3′,

cDNA-R2:5′-GCACTTTATTGGGATTGTT-3′.

以烏鱧肝臟cDNA為模版，進行RCR擴增，反應程序為：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 30 s，共計34個循環，最后72 ℃延伸10 min.PCR產物經質量分數2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測后，用TaKaRa膠回收試劑盒分離純化，再與pMD18-T克隆載體連接并轉化到感受態細胞E.coli DH5,挑取陽性克隆送往上海立菲生物技術有限公司測序.

1.4β-actin序列分析根據測序結果拼接組裝獲得烏鱧β-actin的cDNA序列，在NCBI核酸數據庫作BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對分析，通過在線軟件ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測烏鱧β-actin的開放閱讀框，進一步用Primer 5.0軟件預測蛋白序列，并將序列提交NCBI數據庫.通過Motif Scan程序(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)分析烏鱧β-actin蛋白的功能位點，TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析跨膜結構，并用DNAMAN 8.0軟件分析烏鱧β-actin蛋白的相對分子質量、等電點、氨基酸組成等特征.

1.5分子系統發育分析通過BLAST比對，從GenBank下載獲得的其他物種的β-actin核酸序列和蛋白序列，選取大西洋鮭、虹鱒、斑馬魚、烏鱧、爪蟾、小白鼠和人共7個物種的蛋白序列用BioEdit 7.1軟件進行氨基酸序列比對分析.由于β-actin在不同物種間蛋白序列具有很高的保守性，因此選用核苷酸序列進行分子系統發育分析[5].選取22個物種的β-actin核酸序列，通過ClustalX 2.0[19]進行多重序列比對分析，用DAMBE軟件[20]進行各序列的堿基替代飽和性檢驗，然后用MEGA 6.0軟件[21]，采用鄰位相接法(Neighbor-Joining)，構建烏鱧及其他21個物種β-actin基因的系統發育樹(序列信息見表1)，并用Bootstrap重復1 000次計算各分支的置信度.

表 1 用于進化分析的物種序列信息

1.6β-actin組織表達用Trizol法提取各組織總RNA.各組織RNA經混合后，取1 μg RNA按照TaKaRa反轉錄試劑盒操作說明合成cDNA，以特異性引物:

β-actin qF:5′-CTCCACTCAACCCCAAAG-3′,

β-actin qR:5′-GAGCGTAGCCCTCATAGA-3′

進行半定量PCR.PCR擴增體系為：dd H2O 20.25 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板0.5 μL、rTaq酶0.25 μL，共計25 μL體系.PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共計34個循環，最后72 ℃延伸5 min.PCR產物經質量分數為1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠圖像采集系統中采集圖像.

2 結果

2.1烏鱧β-actincDNA序列的克隆與特征分析以烏鱧肝臟cDNA為模板，擴增獲得長度為909和965 bp兩個PCR產物片段，經過測序及組裝后，得到一個全長為1 813 bp的烏鱧β-actin cDNA序列.序列經BLAST比對確認后，上傳NCBI數據庫(GenBank登錄號：KX925979).經預測，烏鱧β-actin cDNA序列包含一個1 125 bp的開放閱讀框(ORF)，共編碼375個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA；蛋白功能位點分析顯示，在氨基酸序列的53～63位、104～116位及356～364位是烏鱧的β-actin信號位點；在cDNA末段發現了PloyA加尾信號(aataaa)(圖1).

圖 1 烏鱧β-actin cDNA序列及推導氨基酸序列

2.2烏鱧β-actin序列特征分析烏鱧β-actin蛋白由375個氨基酸組成，預測相對分子質量約為41.73 kDa，理論等電點PI為5.16，由20種氨基酸組成，其中甘氨酸(Gly)數目占比最高為7.73%，色氨酸(Trp)數目占比最低為1.07%(圖2).跨膜預測結果顯示，烏鱧β-actin蛋白沒有跨膜區.多重序列比對顯示:β-actin蛋白序列在各物種之間具有很高的保守性，除了個別位點存在氨基酸替換外，其余氨基酸序列完全相同.與魚類相比，烏鱧的β-actin蛋白序列第2位氨基酸是天冬氨酸(Asp)而大西洋鮭和虹鱒的第2位氨基酸是谷氨酸(Glu)，烏鱧β-actin蛋白序列的第319位氨基酸由絲氨酸(Ser)替換為丙氨酸(Ala)；與四足類動物相比，烏鱧β-actin蛋白序列的第228位氨基酸是甘氨酸(Gly),而四足類動物是丙氨酸(Ala)，烏鱧的第279位氨基酸是酪氨酸(Tyr),而小鼠和人是苯丙氨酸(Phe)(圖3).

圖 2 烏鱧β-actin氨基酸組成分析

圖 3 烏鱧與其他動物β-actin氨基酸序列的多重比對

2.3烏鱧β-actin氨基酸與其他物種的同源性分析基于β-actin氨基酸的同源性分析顯示，烏鱧與其他18種動物的β-actin蛋白序列同源性很高，均在98%以上.其中，與人的同源性最低為98.4%，與黃鱔、莫桑比克羅非魚、石斑魚的同源性最高為99.4%,與斑馬魚、大鱗大麻哈魚、大西洋鮭、鳡、黑棘鯛、虹鱒、鯽魚、軍曹魚、鯪魚、塞內加爾鰨、星斑川鰈、非洲爪蟾、雞及小家鼠等動物的同源性介于這兩者之間(見表2).

2.4烏鱧β-actin基因系統發育分析用DAMBE軟件對烏鱧等22種動物的β-actin核苷酸序列進行了核苷酸替代飽和性檢驗，結果表明該基因的堿基替換率均未達飽和，具有系統發育意義.基于Kimura雙參數模型用MEGA 6.0軟件以鄰接法構建了β-actin基因的系統進化樹，結果見圖4.烏鱧首先與大西洋鮭、虹鱒、鱖魚、金頭鯛、羅非魚等鱸形目魚類聚類為一支，再與人、家鼠、變色龍等脊椎動物構成的單支并列聚合為一起，最后再與斑馬魚、鯽魚等鯉形目魚類聚為一支，非洲爪蟾和原雞處于進化樹的根部.系統發育結果與烏鱧的分類地位基本一致.

圖 4 基于β-actin核苷酸序列的NJ系統進化樹

表 2 烏鱧β-肌動蛋白與其他動物的同源性比較%

2.5烏鱧β-actin組織表達分析用獲得的烏鱧β-actin cDNA序列跨內含子設計一對PCR引物，以各組織cDNA為模版進行半定量PCR反應，PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測.結果顯示，β-actin基因在烏鱧肝臟、鰓、腦、眼、心臟、腎臟、肌肉、性腺、胃、脾臟、脂肪等組織均有表達，且特異性很高，PCR產物條帶亮度除了在性腺組織中略低外，在其他各組織的亮度差別不大,結果如圖5所示.

圖 5 烏鱧β-actin基因組織表達

3 討論

本研究利用RT-PCR的方法克隆獲得了烏鱧β-actin基因的cDNA全序列.序列全長1 813 bp，包含一個1 125 bp的開放閱讀框，共編碼375個氨基酸，與鱖魚[5]、寬體沙鰍[6]、鳡魚[9]、大鱗副泥鰍[11]等魚類編碼的氨基酸數目一致.氨基酸序列對比發現，烏鱧β-actin除個別氨基酸與其他脊椎動物有差異，其余的氨基酸序列完全相同，氨基酸序列高度相似性可能與β-actin具有相同的生理功能密切相關[3,6].氨基酸序列分析顯示，烏鱧β-actin蛋白具有3個actin信號位點，這一結果與鱖魚[5]和寬體沙鰍[6]相同，進一步表明不同魚類具有相同的生理功能.跨膜結構域分析表明，烏鱧β-actin蛋白不存在跨膜域結構，不屬于膜蛋白，此結果與寬體沙鰍具有3個跨膜域的結果不一致，可能與預測軟件不同有關.此外，氨基酸組成分析顯示，烏鱧β-actin由20種氨基酸組成，其中甘氨酸(Gly)數目占比最高為7.73%，色氨酸(Trp)數目占比最低為1.07%，這一結果與寬體沙鰍等其他動物的氨基酸含量保持一致.氨基酸同源性分析顯示，烏鱧β-actin蛋白序列與斑馬魚、虹鱒、黃鱔、莫桑比克羅非魚、石斑魚、非洲爪蟾、小鼠、人等動物的同源性很高，均在98%以上，這一結果與鱖魚[5]、寬體沙鰍[6]、鳡魚[9]等其他魚類的研究結果相同，進一步闡述了β-actin蛋白在不同物種之間的保守性.

許多學者認為，由于β-actin蛋白的氨基酸序列在不同物種之間的高度保守性，因此以氨基酸序列構建的系統發育結果不能反映真實的物種之間的進化關系，而以核苷酸序列構建進化樹較為科學[5,9].本研究以β-actin核苷酸序列構建系統發育樹，結果顯示，烏鱧首先與大西洋鮭、虹鱒、鱖魚、金頭鯛、羅非魚等鱸形目魚類聚為一支，再與人、家鼠、變色龍等脊椎動物構成的單支并列聚合為一起，最后再與斑馬魚、鯽魚等鯉形目魚類聚為一支，非洲爪蟾和原雞處于進化樹的根部.表明β-actin基因的進化與物種的進化歷程保持基本一致，這一結果與文獻[5，9]等觀點一致.

由于β-actin在不同的組織細胞中能較高較穩定地表達，且不容易隨年齡的變化而改變，因此常常作為內標基因，廣泛應用于功能基因轉錄表達研究[7].組織表達分析顯示，烏鱧β-actin基因在肝臟、鰓、腦、眼、心臟、腎臟、肌肉、性腺、胃、脾臟、脂肪等組織均有表達，且PCR產物條帶亮度除了在性腺組織中略低外，在其他各組織的亮度差別不大，表明烏鱧β-actin基因在各組織表達相對恒定，可以作為內標基因的候選基因.這一結果與寬體沙鰍的研究結果[6]一致，但與大鱗副泥鰍的研究結果[11]不一致，表明β-actin基因的組織分布仍然具有一定的物種特異性，這可能與動物體的生活環境及生理狀態等因素有關.

4 結論

本研究成功克隆并獲得了烏鱧β-actin基因的全長cDNA，并對該蛋白的氨基酸序列進行了分析，進一步構建了該基因在不同物種之間的系統發育樹，最后對該基因的組織分布進行了檢測.本文首次研究了烏鱧β-actin基因，將為今后烏鱧其他功能基因的研究提供基礎資料，同時也為烏鱧β-actin基因的啟動子研究以及轉基因烏鱧的培育奠定理論基礎.