高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量

胡 蓓，張京順，柯 星，蔣易蓉，周 健，果基施銻，任一平,*

（1.浙江工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江省疾病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310051；

3.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；4.阿爾拉食品原料貿(mào)易（北京）有限公司，北京 100035）

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）是牛酪蛋白經(jīng)單一酶或復(fù)合生物酶水解后的產(chǎn)物，分布于αs1-、αs2-、β-以及κ-酪蛋白中的不同區(qū)域。CPPs已被我國(guó)批準(zhǔn)作為添加劑，應(yīng)用于各種營(yíng)養(yǎng)品、保健食品，能有效提高人體對(duì)鈣、鐵、鋅等二價(jià)礦物質(zhì)的攝入及吸收利用率[1-5]；同時(shí)，CPPs還有預(yù)防齲齒[6-7]、有助于促進(jìn)動(dòng)物體外受精[8]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[9]和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生理功能[10]。CPPs生物活性的核心結(jié)構(gòu)為：-Ser（P）-Ser（P）-Ser（P）-Glu-Glu-（Ser：絲氨酸，Glu：谷氨酸，P：磷酸基）[11]這一結(jié)構(gòu)中，磷酸絲氨酸殘基（-Ser（P）-）成簇存在，在腸道弱堿性環(huán)境下帶負(fù)電荷，可阻止CPPs在消化酶的作用下進(jìn)一步被水解，從而在小腸中穩(wěn)定存在。研究發(fā)現(xiàn)，CPPs中氮磷比越小，其肽鏈越短，磷酸基的密度越大，則促進(jìn)鈣吸收作用越強(qiáng)[12]。此外還有研究證明CPPs的作用效果還與分子中氨基酸組成順序或磷酸基分布有關(guān)[13-14]。CPPs有較強(qiáng)的促進(jìn)鈣吸收作用以及良好的高溫穩(wěn)定性[15]，因此，隨著鈣高效輔助吸收劑的推廣，將CPPs（以牛乳或酪蛋白制品為原料，通過(guò)酶解生產(chǎn)工藝制得的食品添加劑[16-19]）添加到各種產(chǎn)品中，如保健品、兒童營(yíng)養(yǎng)食品等。GB 14880—2012《食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)CPPs可應(yīng)用于嬰幼兒配方食品、糧食和糧食制品、飲料等，并對(duì)使用量（嬰幼兒配方食品中≤3.0 g/kg）作了明確規(guī)定[20]。

目前普遍采用鋇鹽沉淀法[21]、電泳法[22-23]、高效液相色譜法[24-25]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[26-27]測(cè)定CPPs的含量。賴奕堅(jiān)等[26]采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法中SIR模式檢測(cè)鈣片中CPPs的含量，根據(jù)掃描結(jié)果選取離子m/z為454.3的特征峰作為CPPs的代表，并使用SIR模式對(duì)該特征峰進(jìn)行定量，但未對(duì)該特征峰作為CPPs的代表作進(jìn)一步的分析。近幾年，應(yīng)用高分辨色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)不同種屬哺乳動(dòng)物乳的酪蛋白中磷酸化的具體位點(diǎn)[28]以及不同哺乳期中磷酸化位點(diǎn)的變化情況[27]作了較多報(bào)道，但對(duì)應(yīng)用低分辨三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜用于樣品定量分析的方法鮮見(jiàn)報(bào)道。而本實(shí)驗(yàn)針對(duì)嬰幼兒配方奶粉等添加CPPs食品的定量檢測(cè)方法進(jìn)行分析。

本研究依據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)確定酪蛋白氨基酸序列信息，通過(guò)高分辨質(zhì)譜篩選出CPPs原料中具有特異性的肽段，再通過(guò)低分辨串聯(lián)質(zhì)譜的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)建立定量模式。依據(jù)CPPs原料與CPPs特征肽之間的含量關(guān)系，采用同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法測(cè)定強(qiáng)化CPPs嬰幼兒配方奶粉中CPPs的含量。該方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，可滿足目前市售嬰幼兒配方奶粉中CPPs含量的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CPPs原料 丹麥Arla乳品公司；CPPs特征肽LSQSKVLPVPQK、同位素內(nèi)標(biāo)肽LSQSKVL*PV*PQK（L*：Leu-OH-13C6，15N；V*：Val-OH-13C5，15N）（純度＞95%） 上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；甲酸、乙腈、乙酸銨（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；乙酸（優(yōu)級(jí)純）、無(wú)水乙醇（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純） 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；氯化鋇（分析純） 上海泗聯(lián)化工廠有限公司；水為Millipore制備的超純水。

1.2 儀器與軟件

1290 Infinity超高壓液相色譜儀、6460系列三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；Q Exactive Orbitrap、Proteome Discoverer 2.1軟件 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Uniprot蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org）。

1.3 方法

1.3.1 試樣前處理

乳制品中通常蛋白質(zhì)含量較高，而其中酪蛋白又占多數(shù)，在前處理過(guò)程中對(duì)目標(biāo)肽段的提取和準(zhǔn)確測(cè)定會(huì)產(chǎn)生一定影響，因此需要采取適當(dāng)?shù)那疤幚硪匀コ蟛糠值牡鞍赘蓴_。根據(jù)文獻(xiàn)[29]，酪蛋白的等電點(diǎn)為4.6，因此本實(shí)驗(yàn)采用等電點(diǎn)蛋白質(zhì)沉淀法：稱取5 g奶粉樣品，超純水溶解，定容至100 mL，取80 μL，加入50 μL同位素內(nèi)標(biāo)溶液（1 μg/mL），加870 μL乙酸銨-乙酸緩沖溶液（10 mmol，pH 4.6），8 000 r/min（4 ℃）離心5 min。取上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)蛋白沉淀后，再檢測(cè)CPPs特征肽段，方法回收率高（105.4%）、穩(wěn)定性好（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.6%）、實(shí)驗(yàn)操作方便、分析效率高。

1.3.2 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 折算系數(shù)的確定

稱取CPPs原料（共8 個(gè)待測(cè)樣品）各0.1 g于試管中，用超純水將試樣充分溶解后定容至100 mL。定容后取125 μL用超純水稀釋至1.0 mL，渦旋混勻。取80 μL于2 mL試管中，加入50 μL同位素內(nèi)標(biāo)溶液（1 μg/mL）、870 μL乙酸銨-乙酸緩沖溶液（10 mmol，pH 4.6），8 000 r/min（4 ℃）離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜。CPPs特征肽含量計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

式中：Cx1為原料中CPPs特征肽的含量/（mg/100 g）；na1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的原料中CPPs特征肽質(zhì)量濃度/（ng/mL）；v1為原料的定容體積/mL；m1為原料的質(zhì)量/g；F1為待測(cè)原料溶液的稀釋倍數(shù)。

折算系數(shù)即為CPPs原料中CPPs特征肽的含量。根據(jù)公式（1）計(jì)算8 批原料中CPPs特征肽的含量分別為1 071.4、1 113.4、1 043.1、983.2、1 020.4、1 038.5、1 060.0、1 020.3 mg/100 g。將計(jì)算得到的所有批次中特征肽的含量通過(guò)SPSS軟件分析，8 個(gè)批次的原料之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。說(shuō)明不同批次原料中CPPs特征肽的含量較為穩(wěn)定，因此將所有批次中特征肽段含量的平均值1 043.7 mg/100 g作為折算系數(shù)，對(duì)其進(jìn)行換算，折算系數(shù)=1 043.7×10-3g/100 g=1.0×10-2。

1.3.2.2 樣品中CPPs含量的計(jì)算

樣品中的CPPs按公式（2）計(jì)算：

式中：Cx2為試樣中CPPs的含量/（mg/100 g）；na2為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的試樣中CPPs特征肽的質(zhì)量濃度/（ng/mL）；v2為試樣的定容體積/mL；m2為試樣的質(zhì)量/g；F2為待測(cè)原料溶液的稀釋倍數(shù)；f1為折算系數(shù)，本方法中f1=1.0×10-2；f2為CPPs原料中CPPs的百分比含量。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH 300 C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.3 mL/min。流動(dòng)相A：0.1%甲酸溶液，B：0.1%甲酸-乙腈溶液。線性梯度洗脫程序：0～1 min，5% B；1～3.5 min，5%～27% B；3.5～4.5 min，27% B；4.5～5 min，27%～100% B；5～5.8 min，100% B；5.8～6.0 min，100%～5% B，保持2 min，等待下一針進(jìn)樣。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式；毛細(xì)管電壓3.5 kV，脫溶劑溫度375 ℃，脫溶劑氣流量11.5 L/min。多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，CPPs特征肽的監(jiān)測(cè)母離子為3電荷[M＋3H]3＋，監(jiān)測(cè)離子對(duì)為m/z 442.1→372.4和m/z 442.1→568.5，碰撞能量分別為15 eV和10 eV；同位素內(nèi)標(biāo)肽的監(jiān)測(cè)母離子為3電荷[M＋3H]3＋，監(jiān)測(cè)離子對(duì)為m/z 446.3→372.2和m/z 446.3→574.5，碰撞能量分別為15 eV和10 eV。

1.3.5 鋇鹽沉淀法

按照GB 31617—2014《食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑 酪蛋白磷酸肽》[30]方法操作。稱取試樣1.5 g，精確至0.000 2 g，置于50 mL離心管A中，加入15 mL水使其完全溶解。用鹽酸溶液（2 mol/L）調(diào)節(jié)試樣溶液的pH值至4.6，然后置于冷凍離心機(jī)中，于4 ℃、6 000 r/min離心30 min，取上清液于預(yù)先在105 ℃干燥至恒質(zhì)量的50 mL離心管B中，用氫氧化鈉溶液（80 g/L）調(diào)節(jié)上清液的pH值至6.8，控制溶液總量在20 mL以內(nèi)，加入氯化鋇溶液（100 g/L）1.5 mL，再加入無(wú)水乙醇至50 mL，搖勻后于4 ℃冰箱中過(guò)夜。然后，從冰箱中取出置于冷凍離心機(jī)中，于4 ℃、6 000 r/min離心30 min，棄去上清液得沉淀物。沉淀物先在60 ℃干燥箱中烘1 h，再升高溫度至105 ℃烘干至恒質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征肽的選擇結(jié)果

工業(yè)生產(chǎn)CPPs的工藝主要是通過(guò)對(duì)牛奶中酪蛋白的提取、酶解和富集，工藝復(fù)雜，且不同批次之間的含量存在差異，因此含量相對(duì)穩(wěn)定特征肽段的確定是本方法建立的關(guān)鍵。將CPPs原料溶解后經(jīng)色譜分離，通過(guò)高分辨質(zhì)譜（Q Exactive Orbitrap）進(jìn)行全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描（Full MS/dd-MS2）模式掃描，經(jīng)Proteome Discoverer 2.1軟件及Uniprot蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org）分析比對(duì)，確定出不同批次產(chǎn)品中都存在的肽段，如表1所示。

表1 通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)分析所得到的肽段信息Table 1 Peptides obtained from protein database

根據(jù)各批次間肽段含量相對(duì)穩(wěn)定的原則，連續(xù)檢測(cè)3 d，每天按照相同方法處理CPPs原料，檢測(cè)各批次原料中各肽段的含量。從中初步確定肽段含量穩(wěn)定、并且RSD小于15%的7 條肽段（表2），其氨基酸序列分別為L(zhǎng)SQSKVLPVPQK、VLSRYPSYG、LNYYQQKP、AVPITPT、FYQKFPQY、IVPNpS*AEERLHSM、IQKEDVPSERY。

表2 候選肽段的等電點(diǎn)及親水性Table 2 Isoelectric point and hydrophilicity of candidate peptides

在已查找到的7 條肽段中進(jìn)行第2次篩選，選擇特異性強(qiáng)和靈敏度高的肽段作為特征肽用于定量分析。篩選依照的原則：1）避選含有甲硫氨酸（M）的肽段，因甲硫氨酸在暴露的情況下易被氧化[31]，影響對(duì)該肽段的準(zhǔn)確定量。2）選擇含6 個(gè)以上氨基酸的肽段。氨基酸組成個(gè)數(shù)相對(duì)越多，肽段序列越長(zhǎng)的肽段其類同的可能性越小，其特異性越強(qiáng)。3）選擇應(yīng)用本法檢測(cè)可獲得高靈敏度、回收率（接近100%），且穩(wěn)定的肽段。4）盡可能選擇由β-酪蛋白和αs1-酪蛋白所酶解的肽段，由于酪蛋白中β-酪蛋白和αs1-酪蛋白含量最高，易于被檢測(cè)。

根據(jù)以上原則，連續(xù)進(jìn)行3 d樣品同水平加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每天按照相同方法處理CPPs原料，檢測(cè)原料中各肽段的回收率及精密度。結(jié)果顯示，肽段LSQSKVLPVPQK靈敏度高（圖1）。由表3可知，肽段LSQSKVLPVPQK的回收率最佳，并且日內(nèi)、日間精密度均小于5%。綜上，本實(shí)驗(yàn)選擇LSQSKVLPVPQK作為CPPs原料的特征肽。

圖1 所選肽段在CPPs原料中的響應(yīng)Fig. 1 Response of selected peptide fragments in CPPs

表3 各肽段的回收率及精密度Table 3 Recovery and precision (RSD) of each peptide

2.2 同位素內(nèi)標(biāo)肽的設(shè)計(jì)

影響質(zhì)譜定量檢測(cè)最大因素在于基質(zhì)干擾，同位素內(nèi)標(biāo)的使用可以排除基質(zhì)干擾，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。鑒于多肽在電噴霧正離子模式下可產(chǎn)生雙電荷或三電荷離子；另外，碳（1.11%13C）、氮（0.37%15N）元素的天然同位素豐度較高，在質(zhì)譜檢測(cè)器中響應(yīng)較顯著，若同位素標(biāo)記個(gè)數(shù)過(guò)少則會(huì)存在離子干擾，同時(shí)需要考慮檢測(cè)的成本，因此選擇兩個(gè)全同位素標(biāo)記氨基酸（L和V），其質(zhì)量數(shù)與原氨基酸差分別為7和6，同位素內(nèi)標(biāo)的序列為L(zhǎng)SQSKVL*PV*PQK。對(duì)得到的同位素內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)確證，待測(cè)肽段和同位素內(nèi)標(biāo)具有完全相同的色譜行為，并且相互之間不存在干擾。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.3.1 特異性

為驗(yàn)證所選擇的肽段為CPPs的特征肽段，在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)所選肽段只存在于?？苿?dòng)物乳的酪蛋白中，特異性強(qiáng)。此外，選擇嬰幼兒配方粉生產(chǎn)通常涉及的乳清蛋白、全脂粉、大豆蛋白、大米蛋白等不同類型的蛋白進(jìn)行特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，樣品按照1.3節(jié)所述進(jìn)行前處理，相同儀器條件下進(jìn)行分析（圖2）。結(jié)果顯示，上述蛋白在所選肽段離子通道中均不存在干擾峰。

圖2 不同蛋白對(duì)肽段的干擾情況Fig. 2 Interference effect of different proteins on the signature peptide

2.3.2 線性和靈敏度

線性范圍為10～150 mg/100 g，CPPs的相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999。將前處理得到的加標(biāo)樣品溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品成一系列濃度梯度進(jìn)樣，以信噪比為3和10分別為方法檢出限和定量限，為0.3 mg/100 g和1 mg/100 g。

2.3.3 準(zhǔn)確度和精密度

方法準(zhǔn)確性主要通過(guò)3 水平加標(biāo)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估，每個(gè)加標(biāo)水平實(shí)驗(yàn)平行6 次，加標(biāo)水平及回收率結(jié)果如表4所示。精密度則通過(guò)日間、日內(nèi)（連續(xù)重復(fù)3 d）RSD表示，結(jié)果顯示日內(nèi)RSD均小于7.0%，日間RSD均小于8.0%。

表4 準(zhǔn)確度及精密度結(jié)果Table 4 Accuracy and precision of the method

2.4 方法驗(yàn)證應(yīng)用結(jié)果

為了驗(yàn)證方法的適用性，對(duì)5 種嬰幼兒配方奶粉按照建立的方法樣品處理后進(jìn)行測(cè)定。由表5可知，應(yīng)用此方法測(cè)定的嬰幼兒配方奶粉中CPPs的含量與標(biāo)簽標(biāo)示值相近，通過(guò)T檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P值為0.97（＞0.05），說(shuō)明兩組結(jié)果不存在顯著性差異，此方法能準(zhǔn)確的測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中CPPs的含量，因此可用于嬰幼兒配方奶粉的檢測(cè)。鋇鹽沉淀法原理是鋇離子和磷酸化肽段形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，通過(guò)干燥后稱質(zhì)量的方法定量檢測(cè)酪蛋白磷酸肽的含量。本實(shí)驗(yàn)中，鋇鹽沉淀法所得樣品結(jié)果遠(yuǎn)大于標(biāo)示值。可能的原因是樣品中其他組分也和鋇離子結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏高。

表5 嬰幼兒配方奶粉中CPPs的含量Table 5 Actual and measured contents of CPPs in infant formulas

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高分辨質(zhì)譜、Proteome Discoverer 2.1軟件和Uniprot蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢獲得了酪蛋白的詳細(xì)的肽段信息，經(jīng)過(guò)低分辨質(zhì)譜的反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定了7 條可選擇的肽段，再經(jīng)第2次精選，確定序列LSQSKVLPVPQK的肽段作為對(duì)強(qiáng)化CPPs的產(chǎn)品定量檢測(cè)的特異肽段。并且設(shè)計(jì)合成了可提供質(zhì)譜準(zhǔn)確定量的同位素內(nèi)標(biāo)。分別建立了適用與高含量原料和低含量強(qiáng)化樣品的預(yù)處理方法；經(jīng)對(duì)反復(fù)多批次的實(shí)際樣品檢測(cè)確定了特異肽段含量的折算系數(shù)和計(jì)算公式，可根據(jù)原料中CPPs的含量對(duì)嬰幼兒配方奶粉中CPPs的定量檢測(cè)。

方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：方法具有良好的特異性，可排除樣品中其他蛋白質(zhì)的干擾；線性范圍為10～150 mg/100 g，定量限為1 mg/100 g，不同含量樣品的準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果良好。本方法相比于鋇鹽沉淀法具有前處理簡(jiǎn)單、分析速度快、靈敏度高、定量結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)，適用于低含量CPPs的檢測(cè)；本方法的建立為強(qiáng)化CPPs的嬰幼兒配方奶粉中CPPs的定量檢測(cè)提供了行之有效的手段。