GC-IMS結合多元統計分析不同酵母與營養劑對獼猴桃白酒特征香氣的影響

饒文俊,李信,歐陽玲花,祝水蘭,周巾英

(江西省農業科學院 農產品加工研究所,江西 南昌,330200)

獼猴桃以其獨特的風味和營養品質深受消費者的青睞。我國獼猴桃的種植面積和產量均位居世界第一[1]。隨著獼猴桃產業由傳統農業種植模式向現代化種植模式轉型,其產量目前供大于求[2-3]。因此,加大獼猴桃精深加工產品的開發[4-5],對獼猴桃產業高質量快速發展具有很大的意義和前景。獼猴桃白酒作為獼猴桃精深加工產品之一,是獼猴桃經酵母發酵后再進行蒸餾而得到的水果白酒。香氣特性作為評價白酒品質的重要指標之一,也可影響消費者的接受度和整體評價[6]。然而,目前關于獼猴桃酒的研究主要集中在釀造工藝優化[7-8]、酵母篩選[9-10]等方面,但不同酵母對獼猴桃白酒香氣特性影響的報道較少。

氣相色譜-離子遷移光譜法(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)結合了氣相色譜和遷移色譜的雙重優勢,具有樣品制備簡單、分析時間短、靈敏度高等優點,已廣泛應用于食品分析領域[11-13]。HE等[14]采用頂空氣相色譜-離子遷移譜(headspace gas chromatography-mass spectrometry,HS-GC-IMS)對白酒蒸餾過程進行了表征,3D指紋圖譜顯示了不同蒸餾階段揮發性化合物的變化。CHEN等[15]采用HS-GC-IMS結合化學計量學來檢測白酒的年份。本文以獼猴桃為原料,5種不同商業酵母為發酵劑,釀造了獼猴桃白酒,并采用HS-GC-IMS檢測其揮發性香氣成分,通過主成分分析(principal component analysis,PCA)正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)等多元統計分析手段探究了獼猴桃白酒香氣特性的差異,為獼猴桃白酒整體品質及其香氣控制和提升提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

獼猴桃(市售),江西新西藍生態農業科技有限責任公司獼猴桃種植基地。酵母:申聯發酵果酒曲(SLG),四川省申聯生物科技有限公司;諾盟B酵母La Bayanus (La-Ba)、諾盟F酵母La Fruitee (La-Fr),帝伯仕釀酒設備有限公司;安琪果酒酵母SY款(SY)、安琪果酒酵母RW款(RW),湖北安琪酵母有限公司;FN502發酵營養劑,湖北安琪酵母有限公司。

1.1.2 試劑

C4～C9直鏈酮(AR),Sigma - Aldrich貿易有限公司(上海)。

1.2 儀器與設備

EL3002型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;破碎機、304不銹鋼發酵罐20 L,東莞市釀哥機械設備有限公司、蒸餾器600 L,溫州國都輕工機械有限公司;FlavourSpec?氣相離子遷移譜聯用儀,MXT-WAX毛細管色譜柱(15 m×0.53 mm×1 μm),德國G.A.S公司;20 mL頂空進樣瓶,上海賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 獼猴桃白酒制備

工藝流程:獼猴桃→篩選→清洗→破碎→加酵母→調糖(→加營養劑)→裝罐發酵→蒸餾→獼猴桃白酒

挑選一定質量、無破損,成熟度為八九成的獼猴桃鮮果,經清洗、破碎后待用。每1 kg獼猴桃加入0.25 g的商業酵母,使用前將酵母溶解在其質量10倍的溫水糖中(35～40 ℃,含糖5%),攪拌均勻后,靜置20～30 min完成活化。隨后將活化好的酵母混入破碎的獼猴桃中,發酵24 h后加入獼猴桃質量1/10的白糖,隨后繼續發酵15 d,發酵溫度不超過25 ℃。本試驗在發酵第2天按照實際獼猴桃的質量加入營養劑,每1 000 kg獼猴桃加入營養劑200 g,攪拌均勻后繼續發酵,當發酵液中還原糖含量低于2.5 g/L時終止發酵,過濾發酵液后蒸餾即得到本實驗的獼猴桃白酒樣品。

1.3.2 樣品處理

樣品以酵母名稱命名,其中SLG、La-Ba、SY、RW和La-Fr為添加營養劑發酵的樣品;SLG(-)和La-Ba(-)為未添加營養劑發酵的樣品。分別稱取1 g SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)、SY、RW、La-Fr樣品于20 mL頂空瓶中,60 ℃,轉速500 r/min孵育10 min后進樣100 μL,進樣溫度85 ℃,每組樣品取3次作為平行實驗。

1.3.3 GC-IMS測試獼猴桃白酒揮發性香氣物質

GC參數:色譜柱MXT-WAX(15 m×0.53 mm×1 μm),柱溫60 ℃;載氣為高純N2(99.999%);載氣流速0～2 min內保持2 mL/min,2～10 min內線性增長為10 mL/min,10～20 min內增長為100 mL/min,隨后以100 mL/min流速繼續保持20 min。

IMS參數:β射線,氘源,正離子化模式;溫度45 ℃;漂移氣為高純N2(99.999%),流速為150 mL/min。

1.4 數據處理

采用配套軟件GC × IMS Library Search(內置NIST數據庫、IMS數據庫)對化合物進行定性分析;系統自帶Reporter插件對比樣品之間的譜圖差異,Gallery Plot插件用于指紋圖譜對比;SPSS 24.0軟件對數據進行處理,實驗結果以平均數±標準差表示;Origin 2021繪圖;TBtools繪制熱圖與聚類熱圖;通過SIMCA 14.1軟件進行PCA、OPLS-DA分析,計算預測變量重要性投影(variable importance in projection, VIP)。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃白酒GC-IMS光譜對比分析

采用HS-GC-IMS對7組獼猴桃白酒香氣成分進行分析,圖1為Reporter插件制作的二維俯視圖(圖1-a、圖1-b)和差異化譜圖(圖1-c、圖1-d)。在二維俯視圖中,遷移時間和反應離子峰(RIP)均歸一化處理,反應離子峰右側的每一個點代表一種揮發性有機物,顏色表示其濃度。由圖1-a和圖1-b可知,7種獼猴桃白酒揮發性成分相似度較高,大多數信號出現在保留時間200～750 s,漂移時間1.0～1.7 s的范圍內,這說明不同發酵條件下的獼猴桃白酒揮發性香氣成分組成相似。

a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr二維俯視譜圖;b-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)二維俯視譜圖;c-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr差異化譜圖;d-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)差異化譜圖

為了更好地比較不同酵母以及營養劑對獼猴桃白酒香氣的影響,以SLG為參照譜圖,并將其與其他樣品的譜圖進行比較,得到差異化譜圖(圖1-c、圖1-d)。圖1-c中不同酵母發酵條件下,SY和RW與SLG相比,揮發性物質濃度較高,其次是La-Ba;La-Fr揮發性物質濃度與SLG較為相似。圖1-d中,在未添加營養劑的條件下,SLG(-)的紅色面積高于SLG,La-Ba(-)與La-Ba也存在明顯差異。可以看出,不同獼猴桃白酒樣品之間的揮發性香氣化合物含量仍然存在差異,這反映在位置、數量和相應的峰強度上。

2.2 揮發性香氣化合物的鑒定

為了更直觀地表現出不同樣品揮發性物質的變化規律,借助Gallery Plot插件來繪制揮發性物質的指紋譜圖。如圖2所示,在7組獼猴桃白酒樣品中,共檢測出45種信號峰,已定性出33種揮發性物質(表1),其中包含酯類12種、醇類5種、酮類6種、醛類5種、呋喃類3種、其他類2種,未定性化合物12種。

表1 獼猴桃白酒揮發性物質定性分析

a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr樣品指紋譜圖;b-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)樣品指紋譜圖

從圖2中可以看出不同發酵條件下的獼猴桃白酒揮發性物質含量存在明顯差異,在紅色區域A中,SLG樣品乙酸丙酯、2-丁醇、甲酸異戊酯、丁醛、甲乙酮、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、2-甲基丙酸乙酯、丙酸乙酯的含量遠遠高于La-Ba、SY、RW、La-Fr樣品;而區域B中,SY和RW在糠醛、3-羥基-2-丁酮、乳酸乙酯、3-辛酮、丙醛、2-乙基呋喃、正丁醇、辛酸乙酯、2-正丁基呋喃的含量較高;La-Fr樣品則在區域C處的物質含量高于其他樣品,如己酸乙酯。因此,酵母的種類對獼猴桃白酒特征香氣物質有較大的影響。

此外,營養劑對獼猴桃白酒香氣的影響如圖2-b所示,對于SLG酵母而言,營養劑的添加與否對樣品香氣影響程度較大,從圖2中明顯可以看出,SLG和SLG(-)兩組樣品在區域D、區域E中物質含量具有較大差異,如區域D中的物質主要為甲酸異戊酯、2-丁醇、2-甲基丙酸乙酯、丁醛、乙酸丙酯、己酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯、甲乙酮、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯,以酯類物質為主,這些物質在SLG樣品中含量較多,說明SLG樣品相比于SLG(-)具有更濃郁的果香和花香。而在區域E中,未添加營養劑的樣品SLG(-)則含有更多的糠醛、乳酸乙酯、3-辛酮、正丁醇、環戊酮、異戊醛。對于La-Ba酵母而言,營養劑的影響并不明顯,但也存在一定的差異性,如F區域所示,未添加營養劑的樣品La-Ba(-)中3-羥基-2-丁酮、2-正丁基呋喃、2-乙基呋喃的含量大于La-Ba樣品。當然,無論何種發酵條件,7組獼猴桃白酒中都含有大量的異戊醇和異丁醇(圖2黃色區域),這賦予了獼猴桃白酒水果香、甜香和醇香。

2.3 香氣化合物分析

圖3為獼猴桃白酒香氣化合物的相對含量柱狀圖(圖3-a)與熱圖(圖3-b)。從柱狀圖中可以發現,7種獼猴桃白酒中醇類與酯類物質為主要貢獻成分,能夠為獼猴桃白酒提供果香、花香與甜味[20-21]。SLG、La-Fr獼猴桃白酒中酯類物質相對含量大于醇類物質,而La-Ba、SY、RW獼猴桃白酒其結果正好相反。此外,營養劑對獼猴桃白酒香氣物質的影響也有差別。例如,在添加營養劑的情況下,SLG白酒樣品中酯類物質相對含量大于醇類,而未添加營養劑時,SLG(-)樣品中醇類物質相對含量卻遠大于酯類物質。但是,營養劑對酵母La-Ba似乎影響不大,無論添加與否,2種白酒樣品的醇類物質含量均大于酯類物質,這與指紋譜圖中描述的結果相符。從熱圖(圖3-b)中可發現,7種獼猴桃白酒中含量較多的酯類物質為乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸乙酯,這些酯類物質賦予獼猴桃白酒濃郁的果香與花香,醇類物質主要為異戊醇和異丁醇,且與其他香氣物質相比含量更高,另外丙酮、2-丁烯醛的含量也較高,共同構建了獼猴桃白酒的風味。

a-柱狀圖;b-熱圖

2.4 多元統計分析

2.4.1 獼猴桃白酒揮發性香氣PCA

基于獼猴桃白酒香氣物質數據進行PCA,以揭示樣品間的規律性和差異性。首先,對變量為不同酵母的5組獼猴桃白酒樣品進行分析,如圖4-a、圖4-b所示,在得分圖(圖4-a)中可以看出,PC1和PC2分別占總方差的44.8%和28.0%,前2個主成分的累積貢獻率達72.8%,這表明它們足以解釋數據中的總方差。其中SY、RW樣品位于第一象限,SLG、La-Fr、La-Ba樣品分別位于第二、三、四象限,說明5組樣品間香氣具有較大的差異,能夠很好地區分。此外,從載荷圖(圖4-b)中能夠發現,位于第一象限的3-辛酮、3-羥基-2-丁酮、乳酸乙酯、2-乙基呋喃、2-丁基呋喃、正丁醇在SY和RW樣品中含量較高;而第二象限的2-丁醇、丁醛、甲酸異戊酯、乙酸丙酯則在SLG樣品中含量較高;同理,La-Fr樣品中富含異戊醇M、乙酸乙酯;而異戊醛、2-丁烯醛、異丁醇位于右下角,意味著La-Ba樣品中這3種香氣物質含量較高。

a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr樣品得分圖;b-載荷圖;c-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)樣品得分圖;d-載荷圖

其次,研究營養劑對獼猴桃白酒香氣的影響,在得分圖(圖4-c)中可以看出,營養劑的添加情況對樣品的香氣具有很大的影響,樣品之間有效區分,PC1和PC2累計貢獻率高達86.7%,結合載荷圖(圖4-d)可以發現,未添加營養劑的樣品La-Ba(-)含有較多的2-正丁基呋喃、辛酸乙酯,SLG(-)樣品則富含異戊醛、異丁醇、丙酮、糠醛。綜上結果表明,不同的發酵條件導致了獼猴桃白酒香氣成分的顯著差異。

2.4.2 獼猴桃白酒揮發性香氣OPLS-DA

OPLS-DA是一種有監督的判別分析統計方法,能夠建立物質表達量與樣本間關系模型,來實現對樣本類別的預測[22]。如圖5所示,根據7組獼猴桃白酒樣品揮發性香氣物質建立OPLS-DA模型,其中圖5-a～圖5-c用于分析不同酵母對獼猴桃白酒香氣的影響,圖5-d～圖5-f用于分析營養劑對獼猴桃白酒香氣的影響。如圖5-a所示,5組獼猴桃白酒樣品間均能有效區分,顯示了與PCA相同的結果,其中該模型累計貢獻率占85.7%,R2X=0.988,R2Y=0.997,Q2=0.992,當R2和Q2處于0.5～1時,說明該模型有較好的預測能力[23],可以用于區分不同酵母發酵的獼猴桃白酒樣品。此外,還對模型進行了置換檢驗(n=200),以評估判別模型是否對數據過度擬合,如圖5-b所示,左側的所有綠色R2值和藍色Q2值都低于右側的原始點,且Q2點的回歸線與垂直軸(左側)截距為負數,說明該模型沒有過度擬合,預測能力較好,能夠用于不同酵母對獼猴桃白酒香氣影響的判別分析。同樣,對SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)這4組樣品數據建立OPLS-DA模型,如圖5-d所示,4組樣品組內重復性良好,組間具有明顯差異,前2個主成分累計貢獻率占95.1%,R2X=0.996,R2Y=0.998,Q2=0.997,模型穩定性良好。從圖5-e可以發現,Q2回歸線與縱坐標軸的截距小于零,表示模型不存在過擬合,模型驗證有效,因此認為該結果可用于研究發酵營養劑對獼猴桃白酒香氣的影響。

a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr樣品得分圖;b-模型驗證;c-VIP值;d-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)樣品得分圖;e-模型驗證;f-VIP值

此外,將33種揮發性物質對獼猴桃白酒香氣的貢獻進行VIP量化分析,在圖5-c紅色框中可以看出,以不同酵母發酵的獼猴桃白酒,VIP>1的特征化合物分別為乙酸異戊酯、乙酸乙酯、異丁醇、2-丁醇、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、二乙基酮、2-甲基丙酸乙酯;而在營養劑的影響下(圖5-f),有10種VIP>1的特征化合物,分別為乙酸異戊酯、乙酸乙酯、異丁醇、2-丁醇、正丁醇、乙酸異丁酯、二乙基酮、丁酸乙酯、環戊酮、2-正丁基呋喃。為了使結果更具說服力,并使選定的關鍵香氣物質更具代表性,將2個VIP值結果共同的化合物作為最終特征化合物,即乙酸異戊酯、乙酸乙酯、異丁醇、2-丁醇、乙酸異丁酯、二乙基酮、丁酸乙酯被鑒定為在不同發酵條件下有助于區分獼猴桃白酒樣品的香氣。

2.5 聚類熱圖分析

如圖6所示,為了更好地了解獼猴桃白酒樣品間的差異性和相似性,通過初步鑒定的7種特征香氣化合物對變量為不同酵母以及營養劑的獼猴桃白酒進行聚類分析。在不同酵母發酵條件下(圖6-a),依據7種特征香氣化合物可將SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr白酒樣品大致分為兩大類,即樣品RW、La-Ba、SY和樣品SLG、La-Fr,該結果與PCA和OPLS-DA相同。同樣,對SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)4組白酒樣品進行聚類分析,結果如圖6-b所示,4組樣品可分成3類,與上述多元統計分析結果相符。因此,可初步認為乙酸異戊酯、乙酸乙酯、異丁醇、2-丁醇、乙酸異丁酯、二乙基酮、丁酸乙酯為獼猴桃白酒特征香氣物質。

a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr樣品聚類熱圖;b-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)樣品聚類熱圖

3 結論

為了探究不同酵母以及營養劑對獼猴桃白酒香氣的影響,本實驗采用HS-GC-IMS并結合多元統計策略對其進行分析。結果表明,不同發酵條件下獼猴桃白酒的香氣成分組成相似,但在含量上存在差異。GC-IMS共定性出33種揮發性香氣物質,其中酯類12種、醇類5種,7組獼猴桃白酒樣品均以酯類和醇類物質為主。以不同酵母為變量條件下,SLG與La-Fr樣品中酯類物質含量大于醇類物質,而La-Ba、SY、RW樣品則結果正好相反,說明發酵酵母能夠顯著影響獼猴桃白酒風味。對比SLG與SLG(-)樣品的指紋譜圖,其在酯類與醇類物質含量上存在明顯不同,而La-Ba與La-Ba(-)結果較為相似,這說明營養劑對不同酵母的作用程度不同,進而改變獼猴桃白酒品質。PCA與OPLS-DA結果表明,獼猴桃白酒樣品間存在顯著差異,根據VIP值>1,初步鑒定出了7種特征香氣物質:乙酸異戊酯、乙酸乙酯、異丁醇、2-丁醇、乙酸異丁酯、二乙基酮、丁酸乙酯,并用這7種特征香氣物質對不同發酵條件下的獼猴桃白酒分別進行聚類分析,結果與PCA和OPLS-DA一致,說明這7種香氣物質能夠被初步鑒定為獼猴桃白酒的特征香氣物質,為探究酵母以及營養劑對獼猴桃白酒的香氣影響提供了理論參考。