壁虎活性組分抑制人食管癌KYSE150細胞增殖及遷移

段一夢，孔盼盼，黃澤月，王兵兵，段冷昕，王建剛

食管癌是世界范圍內第八大常見癌癥，也是導致癌癥死亡的第六大常見原因[1-2]。中國食管癌的發病率遠遠高于其他國家。作為一種傳統中藥，壁虎具有定驚、祛風、散結和解毒等藥理作用[3]。壁虎活性組分(Gecko active components, GACs)已被證明對多種類型的癌癥(包括肝癌、宮頸癌和喉癌)顯示了抗腫瘤活性，但GACs對人食管癌的抗癌作用及分子機制尚未闡明[4-6]。本實驗旨在探討壁虎活性組分對人食管癌細胞KYSE150細胞增殖及遷移能力的影響與機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞人食管癌KYSE150細胞，由河南科技大學第一附屬醫院新區實驗室惠贈。

1.1.2藥品與試劑多疣壁虎，批號：090301，安徽省亳州市永剛飲業廠有限公司，經河南科技大學醫學院實驗動物中心王曉利高級實驗師鑒定為多疣壁虎；1640培養液(北京索萊寶公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；胰蛋白酶(碧云天公司)；噻唑藍(MTT)粉劑(北京索萊寶公司)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)(美國PALL公司)；BCA試劑盒(北京索萊寶公司)；RIPA裂解液(北京鼎國生物技術有限公司)；彩虹Marker(美國SIGMA公司)； ECL發光液(北京康為世紀生物科技有限公司)。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)一抗、波形蛋白(Vimentin)一抗、GAPDH一抗(武漢ProteinTech公司)；辣根過氧化物酶標記二抗山羊抗兔IgG(武漢ProteinTech公司)。

1.1.3儀器JM-L研磨機(上海諾尼輕工機械公司產品)，MiniTrans-blot電轉膜系統(美國Bio-Rad公司產品)，凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)，ELx800型酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1壁虎活性組分的制備GACs是本實驗室由干壁虎粉劑經研磨、醇沉、旋轉蒸發、冷凍干燥后，經G-25葡聚糖凝膠色譜柱分離，核酸蛋白檢測儀檢測收集的峰Ⅰ活性組分為壁虎活性組分。每次用時稱取適當樣品,實驗前用1640培養液稀釋, 0.22 μm濾膜過濾后用于體外實驗。

1.2.2人食管癌KYSE150細胞培養用含10%滅活胎牛血清的1640完全培養液，于37 ℃細胞培養箱中培養，傳代培養至對數生長期備用。

1.2.3MTT法檢測GACs對KYSE150細胞增殖的影響取對數生長期的KYSE150細胞，加入胰酶消化、計數，計數后將KYSE150細胞調至2.5×104個·mL-1的細胞濃度，將細胞接種到96孔板中(每孔200 μL)并同時設置6個重復孔。按每孔200 μL接種到96孔板，設6個復孔。待細胞貼壁后，加入不同濃度壁虎活性組分培養液，調整GACs濃度分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45，0.5 mg·mL-1，置于37 ℃恒溫培養箱繼續培養。在壁虎活性組分作用于人食管癌KYSE150細胞20、44、68 h后，加人MTT溶液(每孔20 μL)后繼續培養4 h，棄去上清，將DMSO加入96孔板中(每孔200 μL)，將96孔板放置避光處，進行震蕩(10 min)，用酶標儀檢測96孔板每孔的吸光度值(A490)。用下列公式計算抑制率：抑制率(%)=[1-A藥物組/A對照組]×100%。

1.2.4分組與給藥將處于對數生長期的細胞進行消化、計數并種板，根據MTT的實驗結果分為正常組(0)、壁虎活性組分低、中、高3個實驗組 (GACs：0.1、0.15、0.225 mg·mL-1)觀察組。

1.2.5劃痕實驗檢測GACs對KYSE150細胞水平遷移能力的影響取對數生長期細胞接種至六孔板中，接種兩孔，分別為對照組和壁虎活性組分處理組，培養至細胞密度達到80%時，用無菌200 μL槍頭劃痕，PBS輕柔沖洗3次，洗去脫落細胞，對照組用無血清培養液，處理組用不同濃度壁虎活性組分的無血清培養基繼續培養，在0、24 h用顯微鏡觀察并拍照，記錄劃痕愈合面積的變化。

1.2.6Transwell遷移實驗檢測GACs對KYSE150細胞遷移能力的影響利用Transwell檢測細胞的遷移能力。將KYSE150細胞用不含血清的1640培養基饑餓處理后重懸于不含血清的培養基中，濃度為1×105個·mL-1，上室加入100 μL細胞懸液，同時加入100 μL不同濃度壁虎活性組分無血清培養液；在下室中加入含20%胎牛血清的培養基，培養24 h后，取出小室，進行固定及結晶紫染色，顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.7免疫印跡法檢測GACs對KYSE150細胞內蛋白表達的變化將KYSE150細胞接種于6孔板中，分別設置空白組、觀察組。空白組不加藥，觀察組分別加0.1、0.15、0.225 mg·mL-1GACs培養液，繼續培養24 h后，提取各組細胞全蛋白，進行變性SDS-PAGE電泳轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜4次，每次5 min；加入稀釋的E-鈣黏蛋白(1∶2 000)、Vimentin(1∶4 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗溶液，放置冰箱4 ℃孵育過夜。二抗(1∶2 000)室溫下震蕩孵育1 h，采用Bio-Rad凝膠成像系統對實驗結果進行處理及分析。

2 結果

2.1GACs對KYSE150細胞的增殖抑制作用采用梯度濃度壁虎活性組分分別處理KYSE150細胞24 h、48 h、72 h后，24、48、72 h 的IC50值分別為0.22、0.18、0.15 mg·mL-1，結果顯示，隨著壁虎活性組分濃度的增大及時間延長，細胞的相對存活率下降，呈劑量和時間依賴性，見圖1。

圖1 壁虎活性組分(GACs)對KYSE150細胞的增殖抑制作用

2.2GACs抑制KYSE150細胞的水平遷移通過倒置顯微觀察，對照組劃痕面積明顯減少，且趨近融合。GACs組與對照組比較，KYSE150細胞的遷移較慢，劃痕面積較大；隨著GACs藥物濃度的增加，劃痕的愈合率明顯減少。提示GACs能夠抑制KYSE150細胞的水平遷移能力，且藥物濃度越高抑制作用越明顯，見圖2。

圖2 壁虎活性組分(GACs)對KYSE150細胞水平遷移的影響(×200)

2.3GACs抑制KYSE150細胞的遷移GACs藥物組與對照組比較，3個濃度GACs組穿透基膜的KYSE150細胞數顯著減少，且隨著GACs濃度的升高，穿透的KYSE150細胞數目越少。由此可見，GACs可計量濃度依賴性抑制KYSE150細胞遷移，見圖3。

2.4GACs對KYSE150細胞內E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達的影響對照組比較，3個濃度GACs組的KYSE150細胞內E-鈣黏蛋白的表達明顯增高，而波形蛋白的表達明顯降低，且差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖3 倒置顯微鏡下壁虎活性組分(GACs)對KYSE150細胞遷移的影響(結晶紫染色，×200)

圖4 壁虎活性組分(GACs)對KYSE150細胞E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達的影響

3 討論

食管癌是以預后不良為主要特征的癌癥[7-8]。目前，除手術和化療藥輔助治療外，食管癌治療領域缺少療效好、副作用小的治療藥[9-11]。壁虎活性組分能夠通過多種途徑對多種瘤細胞具有抑制作用。本實驗結果顯示，GACs可濃度依賴性地抑制KYSE150細胞的增殖能力及遷移能力。

細胞增殖在腫瘤的發生發展中起著關鍵作用，腫瘤細胞增殖速度快，侵襲鄰近組織并發生遷移，是腫瘤遷移過程中至關重要的一步[12-14]。本實驗發現，GACs能夠抑制KYSE150細胞的增殖能力。惡性腫瘤進一步惡化和引發死亡的病理基礎之一是腫瘤的轉移與侵襲，而腫瘤細胞的轉移是腫瘤轉移的關鍵因素之一。EMT是與腫瘤細胞轉移密切相關的生物學過程，其中E-鈣黏蛋白是EMT代表性分子之一[15]。上皮細胞表達的黏附分子主要有E-鈣黏蛋白等分子，E-鈣黏蛋白是影響細胞黏附強度的蛋白分子之一，在腫瘤細胞中，E-鈣黏蛋白常表現為表達下降，這意味著細胞的活動性增加，黏附能力減弱，進而導致腫瘤的轉移[16-18]。相關研究表明，當細胞發生EMT現象時，腫瘤細胞中E-鈣黏蛋白表達降低，Vimentin表達升高。Vimentin是一種存在于簡直充質細胞的中間絲蛋白，能夠對細胞骨架蛋白、細胞黏附分子等蛋白產生調節，進而對腫瘤細胞的遷移、侵襲、黏附和信號轉導等過程進行調控[19-20]。本研究發現，GACs可上調E-鈣黏蛋白的表達，下調Vimentin的表達，提示壁虎活性組分可能調控KYSE150細胞的EMT進程，進而增加KYSE150細胞間的黏附作用。總之，壁虎活性組分GACs可抑制KYSE150細胞的增殖、遷移，可能與上調E-鈣黏蛋白，下調波形蛋白有關。