不同性別小鼠急性化學性肝損傷中小RNA的比較分析

王善龍，李三強，張勇勇，宋 影，宋曉改，朱文楓

CCl4誘導急性肝損傷模型是一種經典的實驗研究模型，一般認為這種方法重復性好[1]。研究發現，在相同的條件下，不同性別小鼠造模效果有很大差別[2]，但機制仍不十分明確。肝損傷過程涉及許多已知和未知基因，有關肝損傷發生機制的研究取得了長足的進展，但迄今為止肝損傷發生的確切機制尚未明確，闡明肝損傷發生機制并尋求有效的治療方法具有重要臨床意義。

小RNA(small RNAs)主要指長度在18～30 bp的一類非編碼RNA(ncRNAs)，存在于真核生物細胞核和細胞質中，在細胞的生長、發育、代謝等基礎生物學過程中起著重要的作用[3]。本研究通過基因芯片技術檢測不同性別小鼠急性化學性肝損傷模型肝組織中小RNA的表達譜，探索可能影響不同性別急性肝損傷發生發展的差異小RNA，為尋求致病的生物學標志物或干預靶點提供實驗基礎?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1材料清潔健康昆明小鼠雌雄各12只，體質量(20±4) g，河南科技大學醫學院動物實驗中心提供；CCl4為分析純，天津凱通化學試劑有限公司產品；橄欖油(食用油)。

1.2方法

1.2.1模型的制備取體質量(20±4) g的昆明小鼠12只，雌雄各6只，分成4組，分別為雌、雄對照組和雌、雄模型組。各組均自由飲水，普通鼠顆粒飼料喂養。同時給雌、雄模型組小鼠腹腔注射0.1%CCl4橄欖油溶液0.1 mL·10 g-1，在造模后24 h采用頸椎脫臼法處死動物。取小鼠肝臟，迅速放入RNA保存液中，并液氮保存。

1.2.2RNA的檢測提取樣品總RNA，并進行RNA質量檢測，然后使用TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Gold試劑盒消化核糖體RNA，加入打斷試劑將RNA打斷成短片段。以打斷后的RNA為模板，用六堿基隨機引物合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應體系合成二鏈cDNA。在cDNA二鏈合成時以dUTP代替dTTP,然后連接不同接頭，再利用UNG酶法將含有dUTP的一條鏈進行消化，只保留連接鏈不同接頭的cDNA一鏈。使用試劑盒純化cDNA一鏈。純化的cDNA一鏈再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增。

1.2.3數據的處理構建好的RNA文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer質檢合格后，使用Illumina測序儀進行測序，得到了大量的樣本雙端測序數據。鑒于數據錯誤率對結果的影響，采用NGSQCToolkit軟件對原始數據進行質量預處理，并對整個質控過程中的reads數進行統計匯總。對鑒定出來的 miRNA 進行差異篩選，以及功能富集分析。

2 結果

2.1各組小鼠肝組織小RNA的表達分析

2.1.1測序數據統計各組小鼠肝組織檢出clean reads及clean reads uniq見表1，clean reads的長度分布有助于比較不同處理樣本的小RNA情況，樣本中的長度主要分布峰值在21～25 bp的miRNAs，見圖1。從圖中得出，各組樣本的小RNA均以miRNAs為主，本實驗也以miRNAs為主要后續研究對象。

表1 各組小鼠肝組織檢出clean reads bp

注：clean reads：測序后序列經過去雜、質量控制等處理后用于分析的reads；clean reads uniq：clean reads去冗余(即去掉重復的序列)。

圖1 各組小鼠肝組織檢出clean reads長度分布統計

2.1.2小RNA種類繁多，包括miRNAs、tRNA(tiRNA、tRFs)、rRNA、piRNA、snoRNA等。為了對測序結果中的小RNA進行分類注釋，會將clean reads依次和Rfam數據庫[4]、cDNA序列、物種重復序列庫[5]、miRBase數據庫[6-7]進行對比注釋。統計出各組已知的成熟體miRNAs的檢出率，即檢出種類數，見表2。

表2 各組小鼠檢出已知miRNAs統計

2.2表達差異miRNAs表達量計算采用 TPM (transcript per million)計算度量指標[8]，TPM公式=(每條miRNAs比對到的read數目)/(樣本總比對read數目)×106。針對有生物學重復的樣本，采用R中的DESeq包進行差異miRNAs 篩選。針對無生物學重復的樣本，采用Audic_Claverie公式計算p value。并篩選出pvalue<0.05且TPM差異倍數>2的miRNAs。從模型組和正常對照組以及雌性組和雄性組樣本中獲得共得168個差異表達的小RNA，雌性82個，雄性131個，其中有45個在雌雄組均有差異，有37個在雌性特異，有86個在雄性特異，見圖2。

2.2表達模式聚類分析對差異表達miRNAs進行非監督層次聚類。計算多個樣品兩兩之間的距離，構成距離矩陣，合并距離最近的兩類為一新類，計算新類與當前各類的距離，再合并、計算，直至只有一類為止，用挑選的差異miRNAs的表達情況來計算樣品直接的相關性，一般來說，同一類樣品能通過聚類出現在同一個簇中，聚在同一個簇中的miRNAs可能具有相似的生物學功能。用熱圖展示。進一步對差異表達的miRNAs進行聚類分析，發現4組樣本miRNAs的表達模式間存在明顯差別，見圖3。

圖2 差異 miRNAs 維恩圖

紅色:上調的差異表達基因；綠色：下調的差異表達基因。圖3 miRNAs聚類分析及熱圖

2.3靶基因GO富集分析GO分析[9]將差異表達的mRNAs分成3類：生物學過程類(biological process，BP)、分子功能類(molecularfunction，MF)、細胞組分類(cellular component，CC)。GO富集分析top10(篩選3種分類中基因數目前排10位的GO條目)條形圖示意圖見圖4。

3 討論

小RNA是一種由21～23個堿基組成的內源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中。哺乳動物的miRNAs與靶標mRNAs不是序列嚴格互補的完全結合[10]，故而每個哺乳動物的miRNAs都能阻止很多個下游靶標mRNAs的翻譯，從而封閉多個基因的表達。國內外有關miRNAs的研究都集中在生物生長發育、分化、腫瘤、心臟病等慢性生理或病理過程中，在急性損傷病理狀態時的研究報道較少見[11-16]。

圖4 基因數目前排10位的GO條目

本研究對不同性別小鼠急性肝損傷肝組織和正常肝組織樣本的小RNA表達譜予以檢測，并對差異基因進行篩選結果發現：共得168個差異表達的小RNA，雌性82個，雄性131個，其中有45個在雌雄組均有差異，有37個在雌性特異，有86個在雄性特異。RNA表達差異，更大程度地挖掘差異表達的小RNA中真正參與調控疾病發生發展的小RNA。RNA在急性肝損傷中的分子生物學功能及機制展開研究。

總之，本研究結果表明：與正常肝組織比較，急性肝損傷小鼠肝組織出現了明顯的小RNA異常表達，同時不同性別急性肝損傷小鼠的肝組織中小RNA表達明顯異常。這些異常表達的小RNA可能參與了急性肝損傷的發生發展，同時一些信號轉導通路也可能與急性肝損傷的發生發展相關，這為以后研究小RNA在急性肝損傷中的生物學功能及機制奠定了基礎，可能為肝損傷的診療提供新的生物學標志物或干預靶點。