牛糞稻秸新型靜態堆肥中真菌群落組成的動態特征

張文浩，門夢琪，許本姝，許修宏，成利軍，孟慶欣，鄧利廷，姜 欣，武曉桐，盛思遠

（東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030）

靜態堆肥由于不需要擾動堆體結構，不僅可以減少機械能（翻堆、通風等）的消耗，還可以減少以銨態氮為主的含氮化合物的揮發，提高堆肥肥效[1]。但是，由于自然狀態下靜態堆肥的堆體中溫度和氧氣分布不均一，堆肥過程中會出現堆體表面溫度低、堆體深層厭氧的現象，導致表層和深層堆肥效果不佳。本研究針對這一現象，設計了一種靜態發酵裝置（如圖1所示），通過人為地提高環境溫度，同時降低堆體的厚度，旨在保持靜態堆肥固有優點的同時，克服其“堆體表面溫度低、堆體深層厭氧”等技術缺陷。

堆肥實質上是一個微生物演替過程，其微生物類群和豐度決定了堆肥的質量[2]。細菌在堆肥過程中種類繁多，數量龐大，相關報道較多[3]。真菌作為堆肥微生物群落的重要組成部分，在堆肥過程中也起著重要的作用[4]。但是，目前國內外對堆肥過程中真菌群落變化規律的研究報道還比較少[5]。

近年來，研究者采用 T-RFLP[6]、PCR-DGGE[7-10]、16S rRNA克隆文庫[11]等方法分析了堆肥過程中微生物群落結構的變化，但是這些分子生物學方法分辨率較低，不能全面和準確地反映堆肥微生物群落結構。高通量測序技術的出現，可以使人們更準確地描述微生物群落的動態變化及多樣性、研究高度復雜的微生物類群[12]。

本研究采用一種新型的靜態堆肥技術處理奶牛糞污，通過測定堆肥過程中溫度、pH、碳氮比和種子發芽指數（GI）等指標評價堆肥產品的腐熟程度。利用高通量測序技術分析堆肥過程中真菌的群落結構，揭示新型靜態堆肥過程中真菌群落組成的動態變化，并探討群落組成與堆肥理化指標及GI指標之間的相關關系。

1 材料與方法

1.1試驗裝置

圖1 堆肥裝置的橫截面Figure 1 Cross section of the composting system

本試驗裝置的截面如圖1所示。裝置由兩個拼接在一起的由鐵絲網編織成的同軸圓筒組成，距離地面高20 cm。其內筒直徑60 cm，外筒直徑180 cm，高為160 cm。堆肥原料填充在兩個圓筒的夾層中間（堆肥物料厚度為60 cm），形成一個中空的圓柱體（可以容納3.62 m3堆肥原料），這樣堆肥原料的內表面和外表面都能接觸空氣，保證堆體內的氧氣充足。將該裝置置于發酵倉內，發酵倉內溫度保持在40℃左右，并定期通風，保持倉內空氣新鮮。

1.2 堆肥原料及樣品采集

堆肥的原料為充分混勻的新鮮牛糞與切碎至長度為3 cm左右的水稻秸稈（表1），其初始碳氮比為35∶1。堆肥持續17 d。分別在第0、2、4、6、8、10、12、14 d和17 d時進行取樣。取樣時，分別從堆體的三個不同層（分別為：距離堆體底部15 cm—A5和A6點；距離堆體底部80 cm—A3和A4點；距離堆體底部145 cm—A1和A2點），以及每一層的兩個不同深度（外層：距離堆體外表面10 cm—A1、A3和A5點；中心：距離堆體外表面30 cm—A2、A4和A6點）進行取樣（圖1），每個取樣點三次重復，所有點的樣品充分混勻后，為這個時期的樣品。另外，第0 d（初始期）、第2 d（升溫期）、第6 d（高溫期）、第12 d（高溫期后期）和第17 d（腐熟期）不同層及不同深度的混合后樣品置于-80℃環境下保存，用于后續分子實驗分析，并分別命名為C0、C2、C6、C12和C17樣品。

表1 堆肥材料的主要成分Table 1 Properties of raw materials for composting

1.3 堆肥理化以及GI指標的測定

在堆體不同深度（距離堆體外表面10 cm和30 cm）的上、中、下三層（距離堆體底部15、80 cm和145 cm）的6個不同位置，每日使用精密溫度計分別測其溫度并取外層（距離堆體外表面10 cm）及中心（距離堆體外表面30 cm）的不同層溫度的平均值，同時記錄上、中、下三層的環境溫度。含水率的測定采用恒重法，將混勻后的堆肥樣品在105℃下烘干至恒質量，然后進行計算，得出含水率數值。pH的測定是將堆肥樣品按1∶10（質量濃度）比例加入去離子水，振蕩過濾后的濾液用數字pH儀測定。全碳和全氮分別采用重鉻酸鉀容量法和凱氏定氮法[13]測定，兩者的比值即為碳氮比（C/N）。水溶性銨態氮和硝態氮的測定是將堆肥樣品以2 mol·L-1氯化鉀溶液浸提，采用連續流動分析儀（SAN++SYSTEM，荷蘭）測定其含量。種子發芽指數使用獨行菜（Lepidium sɑtivum L.）種子[14]測定。方法為將堆肥樣品按1∶7.5（質量濃度）比例加入去離子水，取5 mL提取液滴入含有濾紙的培養皿中，并將20粒種子均勻分布在濾紙上，在25℃黑暗條件下培養48 h。根據計算公式：GI=處理平均發芽率×處理平均根長/（對照平均發芽率×對照平均根長）×100%，計算種子發芽指數。以上除溫度外的其他指標，每個樣品均進行三次重復測定。

1.4 真菌ITS基因測序

使 用 OMEGA 的 Soil DNA Isolation Kit（Omega Bio-Tek，Inc.，GA，USA）提取堆肥樣品總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。然后進行堆肥真菌總DNA-ITS序列的PCR檢測。ITS序列引物[15]為 ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS2R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。擴增條件為：95℃預變性3 min，接著進行35個循環，包括95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環結束后72℃最終延伸10 min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。高通量測序在上海美吉生物醫藥科技有限公司的Illumina Miseq PE300平臺進行。原始數據提交至NCBI數據庫，登錄號為：SRP121517。

1.5 生物信息處理

利用Mothur（V.1.36.1）對原始DNA序列進行過濾處理，去除嵌合體，得到優化序列；按照97%相似性將優化序列劃分可操作分類單元（OTU，Operational Taxonomic Units）；基于OTU進行稀釋性曲線分析，并計算Chao1豐富度指數，覆蓋度（Coverage）和Shannon多樣性指數等。利用主成分分析（PCA）分析各樣間OTU相似性。對比Unite（Release 6.0 http：//unite.ut.ee/index.php）的真菌數據庫，采用RDP分類器（Version 2.2 https：//rdp.cme.msu.edu/）貝葉斯算法對 97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各個分類水平上統計每個樣品的群落組成；利用Spearman相關性矩陣研究堆肥樣品的理化及GI指標與真菌群落的關系。

1.6 統計分析

采用Microsoft Excel 2016軟件對數據進行處理和分析。用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析（ANOVA）進行差異顯著性檢驗（Tukey HSD法），差異顯著性水平為0.05。

2 結果與討論

2.1 堆肥過程中理化及GI指標的變化

堆肥過程中，微生物快速分解有機質，產生CO2和水，并釋放出大量的熱，使堆肥物料的溫度上升。堆肥過程中溫度的變化可反映微生物活性的變化和有機質的降解程度，并影響最終堆肥產品的成熟度和質量[16]。圖2表示堆肥過程中溫度的變化，從圖中可以看出，外層和中心溫度在堆肥開始后均迅速升高，在第3 d分別達到55.8℃和59.8℃；然后溫度保持上升趨勢并都在第6 d達到最高溫度，分別為56.9℃和61.9℃。外層和中心的溫度從第3 d直到第12 d均保持在55℃以上，在第12 d后，溫度呈緩慢降低趨勢。堆肥過程中溫度的變化表明了三個階段：（1）升溫期（第0～2 d）；（2）高溫期（第3～12 d，＞55 ℃）；（3）降溫及腐熟期（第13～17 d）。根據國家糞便無害化衛生標準（GB 7959—1987）規定，堆肥過程的溫度必須達50～55℃，并持續5～7 d。本研究中，外層和中心溫度連續9 d保持在55℃以上，所以無論堆肥物料的外層還是中心部分，其溫度均符合標準。

堆肥過程中除溫度外的其他指標如表2所示。隨著堆肥的進程，pH保持下降的變化趨勢，與堆肥初始階段的8.77相比，堆肥結束后，pH顯著下降至8.32（P＜0.05），主要由于堆肥中的微生物的代謝作用造成有機酸的大量積累[17]。有報道稱，腐熟堆肥的pH范圍在7.0～8.5[18]。本實驗最終堆肥產物的pH在此范圍內，故其pH符合腐熟堆肥的標準；堆肥過程中含水率保持降低的趨勢，堆料水分由最初的72.0%顯著降低至51.0%（P＜0.05），但是一般腐熟的堆肥產品含水量為40%左右[19-20]。這是由于本研究使用新型靜態好氧堆肥，在堆肥過程中無需進行翻堆，水分損失較少，因此最終堆肥產物含水率相對略高。

隨著堆肥的進程，銨態氮含量變化呈現先升后降的趨勢。在第0～2 d，銨態氮含量從864.8 mg·kg-1顯著上升至932.2 mg·kg-1（P＜0.05），從第4 d開始，銨態氮含量呈顯著下降趨勢（P＜0.05），并在堆肥結束后達到最低，為311.3 mg·kg-1。這是由于在堆肥前期，微生物氨化作用及礦化作用加速了氮素的分解，所以銨態氮含量不斷上升。而堆肥后期由于硝化作用，部分銨態氮轉化為硝態氮，加之氨氣揮發和轉化導致銨態氮含量的下降[21]。堆肥過程中硝態氮含量呈上升的趨勢，由初始階段55.8 mg·kg-1的硝態氮含量顯著上升至堆肥結束后的95.5 mg·kg-1（P＜0.05）。可能是由于過高的溫度抑制了硝化微生物的活性[22-23]，使硝態氮生成和積累的速度緩慢。

碳氮比（C/N）是評價堆肥腐熟的重要指標[21]，并且可以影響堆肥過程中微生物群落的組成[24]。本研究中初始C/N為35.0，堆肥結束時顯著降低至20.0（P＜0.05），依據Xiao等[25]提出的堆肥腐熟度C/N標準，此堆肥產物達到腐熟堆肥的碳氮比的標準。種子發芽指數（GI）是指示堆肥腐熟程度的直接指標[21]。一般認為，GI達到80.0%意味著植物毒性的喪失和堆肥的腐熟[21，26]。本實驗中GI從37.63%顯著上升至97.70%（P＜0.05），表明最終堆肥產物已經喪失植物毒性，并符合腐熟堆肥的GI標準。

圖2 堆肥過程中溫度的變化Figure 2 Changes of temperature during composting process

表2 堆肥過程中理化及GI指標的變化Table 2 Changes of physicochemical and GI indices during composting process

根據堆肥過程中溫度、pH、碳氮比（C/N）和種子發芽指數（GI）等指標綜合推斷，本實驗中采用的新型靜態堆肥技術處理牛糞+稻草秸稈，在堆肥17 d可以使牛糞堆肥達到腐熟。該技術采用中空網狀的圓柱體裝載堆肥物料，可以保證空氣從內外兩個表面進入堆體，在控制堆體厚度的前提下（60 cm），保證了堆體中氧氣的供應。同時通過提高環境溫度，避免了堆體表面低溫層的出現。這樣，就保證了整個堆體處于高溫和好氧的狀態，可以加速堆肥的進程。另外，每個堆體（空心圓柱體）的容積為3.62 m3，在實際生產中可以通過增加堆體的數量來增加該技術的處理能力。因此，該技術在生產實踐中具有一定的使用價值。

2.2 靜態堆肥過程中真菌群落的豐富度及多樣性

表3為5個堆肥樣品中的優化序列、OTU數量及覆蓋率。5個堆肥樣品的高通量測序共獲得191 499條高質量序列。其中，C0、C2、C6、C12和C17樣品高質量序列分別有 35 854、40 426、39 689、41 227條和34 303條。以97%相似度劃分，共得到301個OTUs。其中，C2樣品的OTU數量最高（216），其次為C0（168），C12（126）和C6（120），C17（44）最低。以上數據表明隨著堆肥的進程，檢測到OTU的數量呈先增加后減少的趨勢。各樣品文庫的覆蓋率（Coverage）均超過99.9%，說明堆肥樣品中基因序列被檢出的概率很高，本次測序結果能夠代表堆肥中真菌群落的真實情況。

表3 堆肥樣品中真菌豐富度與多樣性Table 3 Fungal richness and diversity in composting samples

根據5個堆肥樣品中OTU的組成進行樣本聚類分析（圖3），堆肥初始樣本（C0）與升溫期樣本（C2）之間的距離最近，表明兩者OTU組成相近；高溫期樣本（C6）與高溫期末期樣本（C12）的OTU組成也相近，差異性略大于C0與C2；C0、C2與C6、C12樣本間差異較大，但差異性遠小于堆肥腐熟期樣本（C17）與其他四個樣本。結果表明堆肥初始樣本（C0）與升溫期樣本（C2）OTU水平相似，腐熟期樣本（C17）與其他樣本真菌菌群的相似性較低。

圖3 不同堆肥時期樣品中真菌群落組成的聚類圖Figure 3 Hierarchical clustering figure of fungal communities in different compost samples

2.3 靜態堆肥過程中真菌群落組成的動態變化

本研究共獲得4門17綱43目72科118屬。在門分類水平上屬于4個類群（圖4A），主要包括：子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）和未分類真菌界（Unclassified Fungi）。其中，子囊菌門在所有樣本中的相對豐度為6.25%～90.83%。從堆肥的初始階段（C0）至升溫期（C2），子囊菌門的相對豐度由6.25%增加至47.42%，成為最優勢類群；在高溫期時（C6）達到最高（90.83%），并且隨著堆肥進程的推進，其相對豐度一直保持在75.00%以上。隨著堆肥進程，子囊菌門逐漸成為最優勢類群，其主要原因是子囊真菌能夠分泌多種纖維素、半纖維素降解酶，能高效地利用堆肥中的營養元素[27-28]。擔子菌門的相對豐度變化與子囊菌門相反，其在堆肥初始階段（C0）相對豐度最高（83.13%），當堆肥進程達到高溫期（C6）時，下降至7.97%。從高溫期末期（C12）開始，其相對豐度有所上升并保持在22.00%左右。此結果表明，擔子菌門真菌受溫度影響較大，隨著堆體溫度升高，擔子菌門相對豐度下降。接合菌門僅在升溫期（C2）和高溫期末期（C12）被檢測到，其相對豐度分別為0.06%和0.04%。

圖4 堆肥樣品中真菌在門（A）及屬（B）分類水平上群落組成的動態變化Figure 4 Dynamic changes of community composition of fungi during composting process at the level of phylum（A）and genus（B）

在屬分類水平上（圖4B），優勢類群主要包括（至少在一個樣品中相對豐度＞1.0%）：嗜熱鏈球菌屬（Mycothermus）、未分類的子囊菌門（Unclassified Ascomycota）、節擔菌屬（Wɑllemiɑ）、毛孢子屬（Trichosporon）、鬼傘屬（Coprinus）、未分類的真菌（Unclassified Fungi）、擬鬼傘屬（Coprinopsis）、團絲核屬（Myriococcum）、散孢霉屬（Scedosporium）、曲霉屬（Aspergillus）、Remersoniɑ（糞殼菌綱中地位未定的屬）、毀絲霉屬（Myceliophthorɑ）、未分類的角擔菌科（Unclassified Ceratobasidiaceae）、枝頂孢屬（Acremonium）和未分類的毛球殼科（Unclassified Lasiosphaeriaceae）。其中，嗜熱鏈球菌屬的相對豐度在堆肥進程的前期隨溫度的升高而增加，在高溫期達到了83.15%，隨后其相對豐度逐漸降低，腐熟期時僅占2.39%。嗜熱鏈球菌屬是一種嗜熱真菌，能產生具有熱穩定性的木質纖維素酶[29]。它耐熱的特性使其在堆肥的高溫期占據絕對優勢，并起著降解木質纖維素的作用。節擔菌屬是一種廣泛存在于農業環境中的半知菌，可能導致人類患病[30]。毛孢子屬也被認為是人類致病真菌[3]。在堆肥的初始樣品（C0）中，節擔菌屬與毛孢子屬的相對豐度分別占57.41%和22.29%；升溫期（C2）時，節擔菌屬下降至16.08%，毛孢子屬幾乎沒有變化；當堆肥進程進行到高溫期（C6），節擔菌屬和毛孢子屬僅分別含有0.17%、0.63%；在堆肥進程結束時，這兩個屬幾乎檢測不到。鬼傘屬在堆肥的高溫期（C6）開始出現，相對豐度僅為0.62%，到高溫期末期（C12）急劇增加至12.39%，隨后在腐熟期（C17）達到19.50%。Klamer和B??th在馬糞與稻草堆肥的后期發現了鬼傘的子實體[31]。Novinscak等也報道稱在堆肥的中后期發現了鬼傘屬[5]。根據本研究結果與這些報道推測，堆肥后期物料的養分、pH和水分等理化參數適合鬼傘屬的生長。未分類的子囊菌門在腐熟期相對豐度較大，說明其在堆肥進程的后期發揮著重要作用。未分類的真菌在堆肥進程的各個時期均有分布，表明堆肥中的營養成分、含水率、pH等條件適宜其生長，并且其對于堆肥腐熟起到至關重要的作用。綜上所述，節擔菌屬和毛孢子屬在堆肥的初期占據優勢，當堆肥進程到達高溫期時，嗜熱鏈球菌屬成為最優勢類群，隨著溫度的降低，鬼傘屬和未分類的子囊菌門成為腐熟期優勢類群。

2.4 堆肥過程中真菌群落組成與理化及GI指標的相關關系探討

15個優勢屬（至少在一個樣品中相對豐度＞1.0%）與理化及GI指標之間的Spearman相關性熱圖如圖5所示。結果表明節擔菌屬、未分類的真菌和毛孢子屬與含水率、全碳（TOC）、C/N和銨態氮之間呈顯著正相關（P＜0.05），但與全氮（TN）、硝態氮和種子發芽指數（GI）呈顯著負相關（P＜0.05）。鬼傘屬和未分類的子囊菌門與這3個屬相反，它們與全氮、硝態氮和種子發芽指數呈顯著正相關，與含水率、全碳、C/N和銨態氮呈顯著負相關。節擔菌屬和毛孢子屬同屬于擔子菌門中的傘菌亞門，它們與理化指標以及GI指標之間的相關性一致。鬼傘屬屬于擔子菌門中的盤菌亞門，與各指標的相關性卻與節擔菌屬和毛孢子屬相反。此結果表明相同門水平中的真菌對于各指標的響應可能相反。嗜熱鏈球菌屬與溫度呈極顯著正相關（P＜0.001），這與本文中相對豐度部分研究結果一致。

圖5 堆肥中真菌群落組成與理化及GI指標的相關性熱圖Figure 5 Correlation heatmap between community composition of fungi and physicochemical and GI indices in composting

研究表明，特殊類群的微生物可以作為堆肥腐熟度的生物標記。Tortosa等[32]依據堆肥過程中細菌屬的相對豐度變化及其與理化參數之間的相關性，發現了兩個細菌屬可作為堆肥達到腐熟的生物標記。但是，作為堆肥達到腐熟標準的真菌生物標記卻鮮有報道。本研究中，鬼傘屬的相對豐度在堆肥過程結束時達到了19.50%，成為優勢類群。其他學者研究表明，該屬也在堆肥的腐熟期出現頻率較高[5，31]。此外，根據Spearman相關系數得到，鬼傘屬與多數理化及GI指標的相關性較大（R2＞0.80）。綜上，推測鬼傘屬可能作為堆肥達到腐熟期的真菌生物標記。但是，仍需通過進一步研究加以證實。

3 結論

（1）堆肥進程結束后，物料性質滿足腐熟堆肥的各項指標。堆肥過程中理化及GI指標表明，新型靜態堆肥技術下，堆肥達到腐熟的時間縮短至17 d左右。

（2）真菌群落結構分析表明堆肥過程中真菌群落變化明顯，節擔菌屬和毛孢子屬在堆肥的初始期和升溫期占優勢，嗜熱鏈球菌屬為堆肥高溫期的優勢類群，鬼傘屬和未分類的子囊菌門在腐熟期時相對豐度較大。

（3）Spearman相關性分析表明，鬼傘屬與全氮、硝態氮和種子發芽指數呈顯著正相關（P＜0.05），與含水率、全碳、碳氮比和銨態氮呈顯著負相關（P＜0.05），其與多數理化及GI指標的相關性較大（R2＞0.80）。