不同無機氮條件下一種硅藻的氮吸收動力學及模型預測分析

石 峰，魏曉雪，馮劍豐，朱 琳

（南開大學環境科學與工程學院，污染過程與環境基準教育部重點試驗室，天津市城市生態環境修復與污染防治重點試驗室，天津300071）

在海洋環境中，氮是浮游植物賴以生存的必需元素之一，氮循環調控著海洋中氮營養物的可利用性和生物生產力，對于海洋生態系統的功能至關重要。自20世紀中期以來，人類經濟活動的飛速發展，將各種生活污水和工業廢水大量排入江河湖海，近海水體中無機氮含量的快速增長，改變了浮游植物的群落組成和演替規律，打破了水體中原有的氮素轉化平衡，造成了近海河口區域的富營養化及有害藻華頻發[1]。因此有害藻華的防治工作已經成為全世界鄰海國家亟待解決的生態環境問題，氮素營養與浮游植物的關系也成為人們關注的焦點。

海洋生態系統動力學模型作為定量地認識和分析海洋生態系統現象的有力工具，近年來得到了長足發展。用生態動力學模型的方法定量研究浮游植物種群動力學與營養鹽吸收動力學的耦合關系是一個非常重要的方向，Malerba等[11]以Quota模型為基礎，模擬了不同形態的銨-硝氮源、饑餓時間等因素對小球藻（Chlorellɑ sp.）生長的影響。Alijani等[12]則是基于生態化學計量比理論構建模型，用于模擬光強和碳、磷等營養鹽對藻菌關系的影響，該模型較好地模擬了浮游植物和細菌對多變的營養鹽和光照條件的響應。Daines等[13]基于藻類生理功能特征和資源分配平衡角度構建模型，深入分析了藻細胞內氮、磷元素的流向，使動力學模型和生物化學過程得到有機的結合。這些模型都在一定程度上很好地描述和分析了營養鹽與浮游植物之間的相互關系。海洋生物與環境之間的關系錯綜復雜，隨著我們對海洋環境認識的不斷深入，解決這些難題的必要性也日益提升，通過現場實驗結合模型預測的方法為研究這些復雜機制提供新思路。

本文通過分析我國渤海代表性硅藻——三角褐指藻在不同形態、不同濃度無機氮源培養條件下的生長動力學和氮吸收動力學特征，為理解浮游植物銨-硝氮源吸收動力學機制提供一種可能的解釋和補充，為防治有害藻華和探索富營養化條件下優勢藻的形成機理提供理論依據。同時，通過構建簡單有效的動力學模型對試驗所得動力學趨勢進行模擬和預測，力求為相關研究提供一種可行的輔助分析手段。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

三角褐指藻（Phɑeodɑctylum tricornutum）購自中科院海洋研究所微藻種質庫。所購藻種在本試驗室經擴大培養3次以后，即可作為受試藻種。

1.2 培養條件

試驗基礎介質為人工海水[14]（鹽度約為3.5%，初始pH為7.06），培養基選用f/2改良培養基[15]，其中氮源及其濃度根據試驗需要進行調整。藻種置于1000 mL三角瓶，在光照培養箱（LRH-250-GS II人工氣候箱，廣東省醫療器械廠）中進行一次性培養，培養體積為800 mL，初始藻密度約為2×104cells·mL-1，每個處理設3個平行組，培養溫度為（22±1）°C，光暗比為12L∶12D，光照強度為80 μmol·m-2·s-1，每天定時搖瓶3～4次，并隨機變換三角瓶的位置。

1.3 試驗設計

根據試驗需要，設置3個氮濃度，分別為40、60 μmol·L-1和 500 μmol·L-1。其中 40 μmol·L-1和 60 μmol·L-1為接近自然海水中的無機氮濃度，另外為觀察在差異明顯的高濃度氮培養條件下三角褐指藻的生長情況、氮吸收動力學特征、兩種無機氮源的相互關系，以及為驗證模型預測的適用范圍，同時為觀察較高的氨氮濃度是否對藻細胞產生毒性抑制效應[16]，我們依據樊娟[17]的研究結果，選擇 500 μmol·L-1為高氮濃度組。同時設置3種氮源添加方式，Ⅰ組為單加-N試驗組，Ⅱ組為單加-N試驗組，Ⅲ組為-N和-N混合試驗組，具體詳見表1。試驗從接種初始日起，測定初始藻細胞密度、藻細胞內氮素含量和培養基中兩種無機氮濃度，之后每48 h測定一次，直至氮源耗盡，停止試驗。

表1 試驗設計方案Table 1 The scheme of experimental design

1.4 藻細胞計數

利用流式細胞儀計數藻細胞數量。采集約3 mL水樣于低溫保存管中，用終濃度為1%的戊二醛固定，混合均勻后室溫下靜置15 min，液氮冰凍后于-80℃保存備用，樣品后續進行批量檢測。將固定樣品于37℃下水浴解凍，用SYBR Green I染料染色，室溫下黑暗處理15 min，上流式細胞儀（BD C6plus）（設定488 nm，15 mW氬激光），并在530/30 nm測量，根據不同的坐標參數（FITC、SSC、PerCP-Cy5-5-H等）對染色細胞進行區分和計數[18]。

1.5 培養液中-N-N濃度的測定

藻液經0.22 μm濾膜過濾，取濾液，用次溴酸鈉氧化法測定-N，鋅鎘還原法測定-N[19]。

1.6 藻細胞內氮含量的測定

取50 mL三角褐指藻藻液，將藻細胞過濾在0.7 μm Whatman GF/F濾膜（濾膜需預先經450℃煅燒12 h）上，60℃烘干后用元素分析儀（EURO EA3000）測定藻細胞內的N含量（單位為g·50 mL-1）。該部分數據主要應用于模型擬合過程，詳見1.7。

1.7 模型方程的建立與參數估計

本文所構建模型是在參考了Lawson等[20]所建立的一個經典的海洋生態系統模型的基礎上，通過對原模型中一些理化因素（如浮游動物捕食、光照等）進行簡化而得到。不同氮培養條件下模型方程的主要形式如下所示。

（3）混合氮源試驗組

式中：CNH4代表培養基中-N的底物濃度，μmol·L-1；CNO3代表培養基中-N的底物濃度，μmol·L-1；k代表氮的半飽和吸收常數，μmol·L-1；μ代表藻的最大比生長速率，d-1；P代表每升溶液中所有藻體內氮含量，μmol·L-1；γ代表-N對-N的抑制常數；β代表藻類死亡后再生為-N的比例系數；ε代表藻細胞的死亡率，d-1。

其中，P的換算公式為：50 mL溶液中所有藻體內氮含量（μg）×20÷14

模型擬合所需參數是在參考大量前人相關研究成果的基礎上[7，21-24]，初步選定初始值（遵循的原則為：優先考慮三角褐指藻相關的參數，其次考慮與三角褐指藻相近種屬藻類的參數），然后運用本實驗中40 μmol·L-1氮培養條件下3組的試驗數據通過下山單純形法（Nelder-Mead）優化得到試驗參數值。接下來，進一步通過該參數對60 μmol·L-1及500 μmol·L-1濃度試驗組進行模型擬合，驗證模型預測效果。

1.8 數據統計分析

試驗所有數據均使用SigmaPlot 10.0和SPSS 19.0軟件進行統計分析，模型擬合采用R 3.4.3進行。

2 結果與分析

2.1 三角褐指藻在不同氮培養條件下的生長情況

圖1 不同氮源培養條件下三角褐指藻生長曲線Figure 1 The growth curve of Phɑeodɑctylum tricornutum under different nitrogen culture conditions

由圖1可知，本試驗三角褐指藻在各種氮濃度和形態的培養條件下，均能正常生長，且均在第10 d左右進入生長穩定期，但不同濃度下，藻類到達穩定期時的生物量有所差別。3種氮濃度條件下能達到的最大藻密度分別為 40 μmol·L-1培養時為 1.59×106cells·mL-1，60 μmol·L-1培養時為1.82×106cells·mL-1，500 μmol·L-1培養時為4.72×106cells·mL-1。統計分析表明，相同濃度不同形態氮培養條件下，三角褐指藻的生長均沒有顯著差異（P＞0.05），同形態不同濃度下，三角褐指藻生長存在顯著差異（P＜0.05）。

2.2 三角褐指藻在不同培養條件下的氮吸收動力學特征

圖2 不同氮源培養條件下三角褐指藻培養基中氮濃度變化趨勢Figure 2 Changes of the nitrogen concentration in medium for Phɑeodɑctylum tricornutum under different nitrogen culture conditions

由圖2中A、C、D、F、G、I 6圖可以看出，在不同氮濃度培養條件下添加-N的I、III處理組中，-N均能被迅速地吸收利用。而N的情況則不同，在圖2的B、E、H 3圖中，不存在-N的情況下，-N能被迅速的吸收利用，甚至在低濃度氮源條件下（40 μmol·L-1和 60 μmol·L-1）-N作為唯一氮源時其消耗比-N作為唯一氮源時更加快速。但當兩種氮源同時存在時，-N的吸收在前期均出現了不同程度的延遲現象，且延遲時間隨培養環境中-N濃度的增加而增加，說明-N的吸收受到了-N的影響，這一階段-N是藻類吸收的主要氮源形式。

2.3 模型參數優化及擬合結果

通過40 μmol·L-1試驗組數據優化得到的模型參數如表2所示。在此濃度下，擬合I～III各組中藻細胞內氮濃度和培養基中氮濃度的試驗觀測值和模型預測值的決定系數R2分別為0.953（圖 3A）、0.985（圖3B）；0.911（圖4A）、0.982（圖4B）；0.924（圖5A）、0.986（圖5B）、0.981（圖5C）。

2.4 不同培養條件下藻體內氮濃度及培養基氮濃度的預測

進一步用優化后的模型對60 μmol·L-1及500 μmol·L-1試驗組所得趨勢進行預測，結果如圖3～圖5所示。模型預測值與試驗觀測值均十分吻合，決定系數R2全部介于0.780～0.986之間，說明該模型能很好地預測三角褐指藻在各濃度、各形態氮源下的生長動力學和氮吸收動力學趨勢。

表2 模型參數匯總Table 2 Summary table of model parameters

圖3 三角褐指藻在-N不同濃度培養條件下藻體內總氮含量和培養基中氮濃度變化趨勢模型擬合結果Figure 3 Model fitting results for total intracellular nitrogen content and changes of nitrogen concentration in medium under different concentration of NH+4-N

圖4 三角褐指藻在-N不同濃度培養條件下藻體內總氮含量和培養基中氮濃度變化趨勢模型擬合結果Figure 4 Model fitting results for total intracellular nitrogen content and changes of nitrogen concentration in medium under different concentration ofN

3 討論

氮是浮游植物細胞內核酸、蛋白質和葉綠素等的基本元素之一，在浮游植物的生命活動中占有非常重要的地位。自然界中除少數藍藻具有自身固氮能力外，藻類必須從環境中吸收一定的氮源以滿足其生長、繁殖的需要，同時不同種類的微藻對氮源的種類和濃度需求也不一樣[25]。從本試驗中藻類生長動力學結果可以看出，氮濃度的改變對三角褐指藻的生長影響顯著，同形態不同濃度的氮培養條件下，藻類生物量均存在顯著差異（P＜0.05），證明了氮素營養是三角褐指藻生長的一種非常重要的限制因子。與此同時，同濃度不同形態氮培養條件下，三角褐指藻的生長卻沒有出現明顯差異（P＞0.05）。一般認為微藻最容易利用-N，但是隨著-N被利用，培養液的pH逐漸下降，以至于抑制微藻的生長，因而高濃度的N反而會抑制微藻的生長[26]。本試驗的結果表明，500 μmol·L-1-N試驗組中藻類的生長與其他同濃度試驗組沒有明顯差異，說明該濃度的-N并沒有對三角褐指藻的生長產生抑制效應，這也證明一定濃度范圍內，三角褐指藻均能很好地利用-N和-N兩種無機氮源，這與Yongmanitchai等[27]的研究結果是一致的。

另外，對藻類氮吸收動力學特征進行分析，在3種不同氮濃度的培養條件下，單一添加-N或-N時，氮營養均能被藻類快速吸收，而兩種無機氮源同時存在時，則出現了明顯的-N吸收延遲現象。對于這樣的特征，目前有幾種可能的解釋：首先，藻類可能會根據所處環境中氮源的多少及形態對吸收氮源的策略進行自我調整，對三角褐指藻而言，已有研究證明其對各種氮源均具有廣泛的利用性[27-28]，因此當環境中存在-N或-N為唯一氮源時，其均能很好地吸收利用。而當環境中同時存在-N和-N時，藻類則會改變吸收策略。由于吸收-N不需要轉換氮的價態并消耗相應的能量，因此，藻類很可能優先利用-N[29]。這一特征也在大量的室內藻類培養及實際水體研究中得到了較充分的證實[7]。同時，除藻類對其偏好性吸收外，-N的存在也可能抑制硝酸鹽還原酶、轉運酶等的活性，損害藻類吸收-N的能力[30-31]。另外，值得注意的是，由于不同種類的微藻對氮的種類和濃度需求不同，它們對于-N和-N的利用以及不同環境下氮吸收策略的差異在自然環境中具有重要意義。在河口及近岸海域，由于陸源輸入的影響，經常會出現脈沖式營養鹽輸入，那些能更加快速適應氮環境變化的藻類，很可能迅速成為優勢種，進而改變浮游植物的群落結構，甚至進一步引發藻華[11]。

圖5 三角褐指藻在混合氮源不同濃度培養條件下藻體內總氮含量和培養基中氮濃度變化趨勢模型擬合結果Figure 5 Model fitting results for total intracellular nitrogen content and changes of nitrogen concentration in medium under different concentration of mixed nitrogen（-N and -N）

本文通過構建數學模型模擬了三角褐指藻在不同氮源培養條件下的氮吸收動力學特征。值得注意的是，模型中參數的取值大小很大程度上影響著計算結果，因此選取合適的參數值，對模型預測結果的準確性至關重要。但在實際環境評價工作中，有些參數往往難以測定，同時由于有針對性的現場觀測和模擬實驗數據匱乏，致使無法向模型提供理想的參數，進而降低了模擬結果的準確性。因此在借鑒相關經驗值的基礎上對參數進行優化是十分必要的。自20世紀60年代開始，隨著計算機技術的普及和迅速發展，參數自動估計方法得到了普遍應用，大幅加快了參數優選的速度，增加了模擬結果的客觀性和可信度[32]。并且隨著參數自動估計方法的發展，優選算法也變得多種多樣[33]。單純形法，又稱之為下山單純形法，是一種經典的直接搜索最優解算法，由Nelder和Mead提出[34]。該方法由一組解構成初始單純形，在每次迭代中，逐步剔除最差解，并尋求更好的解。該方法實現簡單、性能良好、精度高，適合計算變量數不多的方程求極值。目前在不同研究領域都有較為廣泛的應用[35-37]，本文運用單純形法對營養鹽吸收動力學模型中的參數進行優化求解。通過優化所得到的參數符合藻類生長和營養鹽吸收動力學相關性研究的常規經驗值，同時通過在兩種具有明顯差異的氮濃度培養條件下（60 μmol·L-1和500 μmol·L-1）對模型預測能力驗證，其均可以較好地預測試驗結果，說明我們通過單純形法所優化的模型參數基本符合本研究中微藻的真實生理特征。

4 結論

（1）三角褐指藻在各種氮濃度和形態的培養條件下，均能正常生長。同濃度不同形態氮培養條件下，三角褐指藻的生長均沒有顯著差異（P＞0.05），同形態不同濃度下，三角褐指藻生長差異顯著（P＜0.05）。

（3）通過構建營養鹽吸收動力學模型模擬了三角褐指藻在不同氮源培養條件下的生長和氮吸收動力學特征。模型預測值與試驗觀測值均十分吻合，決定系數R2全部介于0.780到0.986之間，該模型很好地預測了三角褐指藻在各濃度、各形態氮源下的生長動力學和氮吸收動力學趨勢。