不同品種煙草對Cd的富集及根際有機酸的分泌特征

余 浩，王幽靜，宋 睿，潘彥碩，王長青，劉炳杉，李本銀，李烜楨*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學林學院，鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，鄭州 450002；3.華南農(nóng)業(yè)大學材料與能源學院，廣州510642；4.河南農(nóng)業(yè)大學現(xiàn)代實驗技術管理中心，鄭州 450002；5.河南農(nóng)業(yè)科學院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，鄭州 450002）

隨著社會不斷發(fā)展，土壤污染問題越來越嚴重，其中土壤重金屬污染問題尤其突出。據(jù)統(tǒng)計，我國受重金屬污染的耕地占總耕地面積的五分之一，其中Cd污染最為嚴重[1]。土壤受Cd污染后，會通過生物富集作用進入人體，危害人體健康。目前土壤重金屬污染修復方法主要有物理、化學和生物方法等，但物理和化學方法修復成本高，并且會在一定程度上破壞土壤結構，容易造成二次污染，因此不適用于農(nóng)田污染治理[2-3]。植物修復技術因具有成本低、環(huán)境友好等優(yōu)勢而被廣泛應用于農(nóng)田土壤重金屬污染的修復[4]。

目前發(fā)現(xiàn)的Cd超積累植物，如有翅星蕨（Microsorum pteropus）、遏藍菜（Thlɑspi cɑerulescens）等，多因生長緩慢、生物量低、栽培困難等較難應用于實際[5-6]。煙草是世界上較廣泛種植的一種作物，其生物量大，并且對重金屬有較強的吸收和積累能力，因此煙草可能被用于土壤重金屬污染的修復[7]。張艷玲等[8]研究了497份烤煙樣品的重金屬含量發(fā)現(xiàn)，煙草中Cd含量遠高于其他重金屬，葉片平均Cd含量為2.95 mg·kg-1，最高可達19.35 mg·kg-1。煙草對Cd的吸收積累能力品種間差異明顯，劉登璐等[9]對93個煙草品種的Cd耐受性進行評價，發(fā)現(xiàn)了“達白一號”、“長脖黃”等多個對Cd具有高積累特性的品種。目前關于煙草富集重金屬的研究不多，且大都集中在篩選Cd的低積累品種用于煙草栽培，而很少有人從環(huán)境角度考慮將煙草用于土壤重金屬污染的修復。

本研究以來源廣泛的7個煙草品種為供試材料，采用盆栽實驗方法，研究了Cd脅迫下不同品種煙草的生長狀況，探索了Cd在煙草不同器官的分布規(guī)律，初步篩選了對Cd富集能力強的品種，還研究了Cd脅迫下煙草根際有機酸的分泌特征，以期為Cd污染土壤的現(xiàn)實修復提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

煙草品種為中煙100、粵煙96、NC628、K326、長脖黃、云煙87和8326，均由河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)提供。供試土壤采自河南農(nóng)業(yè)大學校園，土壤類型為褐土，采樣深度為0～20 cm，將土壤風干后，去除動植物殘渣、碎石，過2 mm篩，備用。

土壤pH采用水浸提，微機型酸度計（杭州齊威儀器有限公司）測定（水∶土=2.5∶1）；有機質采用重鉻酸鉀容量法檢測；速效磷采用NaHCO3溶液浸提，鉬銻抗比色法檢測；速效鉀采用醋酸銨浸提，火焰光度計（上海傲譜）檢測；堿解氮采用堿解擴散法檢測；全Cd采用微波消解（美國CEM），原子吸收分光光度計檢測（日本日立公司Z-2000）。所用試劑均為優(yōu)級純，供試土壤基本性質見表1。

表1 供試土壤的基本性質Table 1 Basic properties of the experimental soil

1.2 實驗處理

實驗于河南農(nóng)業(yè)大學氣候室進行，向土壤（過2 mm篩）中添加CdCl2粉末（無結晶水），采用“二分法”混土，將652 mg CdCl2粉末混于40 kg土中（理想條件下混合后Cd含量接近10 mg·kg-1）；先將163 mg CdCl2粉末和200 g土小范圍均勻混合，再加入163 mg CdCl2和200 g土繼續(xù)均勻混合，連續(xù)添加將652 mg CdCl2混于1 kg土中；再按照上述方法將含有Cd的1 kg土與39 kg土混合。平衡一周后，5點取樣法取樣，測定Cd含量為9.4 mg·kg-1，分裝。每個煙草品種均設5個重復，以不種煙草作為對照。基肥（煙草專用肥不含Cd）與土壤均勻混合后裝入塑料盆缽中，選擇生長狀況均勻一致的煙苗（四葉一心）移栽，每盆1.0 kg土定植一株。每天光照10 h，溫度28℃；夜晚14 h，溫度18℃；濕度為70%。

1.3 樣品采集與測定

煙株移栽30 d后采集樣品，先用抖土法[10]去掉非根際土，然后用毛刷將附著在根系周圍的土壤輕輕刷下來作為根際土，保存至-20℃冰箱備用。隨后將去土后的煙株用蒸餾水潤洗，再用去離子水反復沖洗干凈，用不銹鋼剪刀將根、莖、葉分開，于105℃下殺青30 min，65℃烘干至恒質量并稱量，經(jīng)微波消解[11]后，趕酸，轉移并定容至25 mL，用乙炔-火焰原子吸收光譜法測定煙草中Cd含量。

有機酸測定：測定根際土壤中草酸、蘋果酸、檸檬酸、甲酸和乙酸的含量，有機酸均為色譜純。稱取根際土壤樣品5 g于25 mL離心管中，加10 mL 0.1%的H3PO4水溶液，振蕩3 min 后，在 5000 r·min-1轉速下，離心5 min。過水相0.45 μm濾膜，用高效液相色譜儀（美國Agilent公司）檢測。色譜條件：流動相為0.01 mol·L-1磷酸緩沖液（pH=2.7）；進樣量為20 μL；流速0.5 mL·min-1；柱溫 30 ℃；檢測波長210 nm[10]。

根富集系數(shù)=煙草根Cd含量/土壤Cd含量

莖富集系數(shù)=煙草莖Cd含量/土壤Cd含量

葉富集系數(shù)=煙草葉Cd含量/土壤Cd含量

去除率=（根Cd含量×根生物量+莖Cd含量×莖生物量+葉Cd含量×葉生物量）/（土壤Cd含量×土壤質量）×100%

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結果用Excel 2016處理，SPSS17.0顯著性分析，Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 不同品種煙草生物量的差異

本研究通過盆栽實驗比較了Cd脅迫下不同品種煙草生物量（干質量）的差異（圖1），在土壤Cd含量為9.4 mg·kg-1條件下，不同品種煙草生物量呈現(xiàn)葉＞莖＞根的趨勢。“長脖黃”根、莖和葉的生物量均最大，分別為1.17、1.45 g和4.3 g，“長脖黃”葉的生物量與其他品種間差異達顯著水平（P＜0.05）。

圖1 不同品種煙草生物量Figure 1 Tobacco biomass of different varieties

2.2 不同品種煙草根、莖和葉Cd含量

通過檢測煙草根、莖和葉中的Cd含量發(fā)現(xiàn)（圖2），“云煙87”葉 Cd含量最高，達 64.67 mg·kg-1，其次為“8326”和“長脖黃”；“長脖黃”莖Cd含量最高，達27.1 mg·kg-1，其次為“中煙100”和“云煙87”；“8326”根Cd含量最高，達 23.75 mg·kg-1，其次為“粵煙 96”和“NC628”。不同器官的Cd含量均呈葉＞莖＞根的趨勢，例如“長脖黃”根、莖、葉Cd含量分別為14.3、27.1、63.02 mg·kg-1。煙草葉片中Cd含量遠高于根和莖，這種現(xiàn)象說明煙草生長期間對Cd有較強的轉移能力。

圖2不同品種煙草根、莖和葉Cd含量Figure 2 Cd concentration in roots，stems and leaves of different varieties of tobacco

2.3 不同品種煙草對Cd的富集系數(shù)

圖3 顯示“云煙87”葉對Cd的富集系數(shù)最高達6.88，其次為“8326”（6.77）和“長脖黃”（6.7）；“長脖黃”莖對Cd的富集系數(shù)最高達2.88，其次為“中煙100”（2.84）和“云煙 87”（2.82）；“8326”根富集系數(shù)最高達2.53，其次是“粵煙96”（1.81）和“NC628”（1.54）。煙草不同器官富集系數(shù)均呈現(xiàn)葉＞莖＞根。Baker[12]認為，超累積植物富集系數(shù)遠大于1，而排斥型作物富集系數(shù)通常小于1。以此標準判斷，在9.4 mg·kg-1條件下，煙草不同器官對Cd的富集系數(shù)均大于1，其中煙草品種“云煙87”葉對Cd的富集系數(shù)達到6.88，說明煙草對Cd有比較強的富集能力，有望用于實際土壤Cd污染修復中。

圖3 不同品種煙草對Cd的富集系數(shù)Figure 3 Enrichment coefficient of different varieties of tobacco to Cd

2.4 不同品種煙草對Cd的去除率

修復植物對土壤中重金屬的去除率是評價植物修復能力的最終指標。本研究發(fā)現(xiàn)“長脖黃”對Cd的去除率最高為3.48%，“NC628”對Cd的去除率最低為2.21%，兩者相差36.5%，差異達顯著水平（P＜0.05）（圖4）。楊勇等[6]通過盆栽實驗比較超富集植物印度芥菜、遏藍菜和高生物量植物煙草對土壤中Cd的去除率，發(fā)現(xiàn)在1.0 kg土中生長60 d后，煙草對Cd的去除率遠高于遏藍菜和印度芥菜。

圖4 不同品種煙草對Cd的去除率Figure 4 Cd removal rate of different varieties of tobacco

2.5 Cd脅迫下不同品種煙草根系分泌的有機酸

本文研究了不同品種煙草根際土壤5種有機酸含量，發(fā)現(xiàn)不同品種煙草根際土壤中均檢測到了草酸；除粵煙96外，其他煙草品種根際土壤均檢測到了乙酸，“中煙100”和“粵煙96”根際土壤中檢測出少量蘋果酸；“粵煙96”和“8326”根際土壤中檢測出少量甲酸；在對照土壤中檢測出少量的草酸、蘋果酸和乙酸（表2）。不同品種煙草根際土壤中檢測出草酸的含量均遠高于其他酸，其中“長脖黃”分泌的草酸含量最高達 16.23 mg·kg-1，“NC628”最低為 10.2 mg·kg-1，差異達到顯著水平（P＜0.05）；“NC628”乙酸含量最高為 0.31 mg·kg-1，“云煙 87”乙酸含量最低為 0.2 mg·kg-1，差異達到顯著水平（P＜0.05）（表2）。

3 討論

有學者[13]研究了多種高生物量植物對重金屬的富集能力，發(fā)現(xiàn)用于植物修復技術的植物種類不一定局限于超富集植物，尋找與開發(fā)大生物量、富集重金屬能力強的修復植物是首要任務。從圖1看出煙草品種“長脖黃”生物量比其他品種大，且生長過程中未出現(xiàn)明顯毒害現(xiàn)象。本研究為室內(nèi)控制實驗，煙草的生長期為30 d，因此生物量比大田生長的小。在大田生長條件下，“長脖黃”屬于高產(chǎn)品種，據(jù)報道其僅煙葉產(chǎn)量（干質量）可達3000 kg·hm-2，因此具備了進行土壤重金屬污染修復的先決條件[14-15]。

本試驗研究表明（圖2）不同品種煙草對Cd均有較強的富集能力，并且葉片為煙草儲存Cd的主要場所，這與其他研究結果類似，例如袁祖麗[16]通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，當土壤中Cd的添加量達到10 mg·kg-1左右時，煙草葉片Cd含量高于根；賀元等[17]通過盆栽實驗發(fā)現(xiàn)Cd含量在4.8 mg·kg-1下煙草葉片中的Cd含量（110 mg·kg-1）顯著高于莖（25 mg·kg-1）和根（12 mg·kg-1）。其他植物類似，如朱艷霞[18]發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下東南景天不同部位 Cd含量為葉（180 mg·kg-1）＞莖（100 mg·kg-1）＞根（80 mg·kg-1）。有研究表明植物葉片的葉肉細胞在植物對Cd的解毒過程中起主要作用，這是因為Cd主要區(qū)隔在液泡和細胞壁等代謝不活躍的部位。在葉肉細胞中有大型液泡，液泡中富含蛋白質、有機酸和巰基化合物等都能與重金屬結合降低重金屬毒性；細胞壁中如木質素和各類蛋白等也能與重金屬結合，因此煙草葉片的Cd含量高于根和莖[19-21]。

富集系數(shù)是衡量植物對重金屬積累能力的一種重要參考標準，富集系數(shù)越大，說明植物對重金屬的吸收能力越強[22]。從圖3發(fā)現(xiàn)不同品種煙草均對Cd有較強的吸收能力。從煙草與超富集植物對Cd的去除率比較發(fā)現(xiàn)，將高生物量、高富集能力的煙草品種“長脖黃”用于土壤Cd污染修復是可行的。

根系分泌的有機酸可能是影響植物吸收重金屬的重要因素[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，煙草品種“長脖黃”對Cd的去除率最高，同樣根際土壤草酸含量也最高，“NC628”去除率最低，根際土壤草酸含量也最低，因此可以推測，在Cd脅迫下煙草根系分泌較多的低分子量有機酸尤其是草酸可能是煙草對Cd具有較高富集能力的原因之一，這可能與有機酸的解離程度有關。草酸的解離常數(shù)高，更容易解離和釋放H+，一方面降低了土壤pH，增加Cd的有效性；另一方面與土壤中的Cd螯合，促進了土壤中重金屬的釋放和煙草對重金屬的吸收[24-26]。

表2 Cd脅迫下不同品種煙草根系對有機酸的分泌（mg·kg-1）Table 2 Secretion of organic acids from different tobacco roots under Cd stress（mg·kg-1）

4 結論

（1）在Cd脅迫下，7種供試煙草品種中“長脖黃”對Cd的去除率最高，因此，該品種有望成為一種新的Cd污染土壤的修復植物。

（2）不同煙草品種均分泌了草酸，其次為乙酸。在Cd脅迫下煙草根系分泌較多的低分子量有機酸尤其是草酸可能是煙草對Cd具有較高富集能力的原因之一。