Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）對水稻根伸長抑制的生態毒性研究

朱婷婷，王玉軍，周東美，施維林，黨 菲

（1.蘇州科技大學環境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215009；2.中國科學院南京土壤研究所土壤環境與污染修復重點實驗室，南京210008）

銻（Sb）是人體和植物的非必需元素，具有潛在的慢性毒性和致癌性[1]。Sb會抑制植物發芽和生長，抑制光合作用，影響膜結構和通透性[2]。Sb通過呼吸、飲食或皮膚等暴露途徑進入人體后，不僅干擾體內糖與蛋白質的代謝，損害心臟、肝臟及神經系統，還會對黏膜產生刺激作用[3]。由于Sb具有較好的阻燃性，能增加子彈的硬度等特性，廣泛應用于各行各業，人類對Sb的需求量越來越大，使得Sb礦的開采等活動急速增加。我國是世界上最大的Sb資源大國，儲存量和產量均居于世界首位，且多年Sb產量達到世界總產量的80%[4]。近年來，隨著含Sb礦產的大量開采，Sb礦周邊土壤受到嚴重污染。Sb環境污染問題已經引起廣泛的重視，目前國內外對Sb的生態毒理研究主要集中在植物、藻類對Sb的吸收[5]和積累過程[6-7]以及Sb對植物、藻類光合作用的脅迫[8]等，總體來說研究比較散，不夠系統，由于缺乏系統性的生態毒性閾值研究，迄今為止，我國還未頒布關于Sb的土壤環境標準，因此開展Sb生態毒性和閾值研究就顯得尤為重要。

水稻是中國乃至亞洲的主要糧食作物之一，世界上有90%的水稻產于亞洲。我國是水稻生產消費大國，大約有65%的人是以水稻為主食[9]，南方Sb礦周邊種植大量的水稻，對水稻生長造成一定的污染，湖南省Sb礦山附近的水稻土中檢測到Sb的含量是1565 mg·kg-1[10]，是WHO推薦的土壤Sb污染最大允許濃度36 mg·kg-1的43倍，水稻植株的根和種子積累分別高達225 mg·kg-1和5.79 mg·kg-1[11]。根伸長抑制率是評價重金屬生態毒性的一個重要指標[12-13]。本研究選取全國各地、各種類型的水稻作為研究對象，研究不同品種水稻對Sb脅迫的響應差異，以根伸長半抑制最大效應濃度（Concentration for 50%of maximal effect，EC50）作為主要參考，對比水稻根部Sb的吸收，及SOD酶和MDA等生理生化指標，比較不同品種水稻對Sb的敏感性，初步探究Sb致毒機理，為污染地區種植水稻品種的選擇提供依據；同時為開展Sb毒性閾值和生態毒性研究及我國Sb標準的建立提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

（1）水稻品種：供試水稻品種共44種，包括連糯一號、浙優18、鄂豐28、南粳5055、II優7954遠雜綠稻Q7、徐旱1號、淮粳5號、紫香米、南粳9108、武育糯16號、綠旱、6兩優 9368、旱稻 998、川香優 2號、錢優0506、岡優177、鎮秈優184、錢優1號、春優84、徽兩優898、川優6203、黑稻、錢優0508、龍慶稻1號、超級旱稻502、龍稻20、岡優7954、富禾66、旱稻65、深兩優5183、蘇育糯、黑糯米、荊兩優1198、II優1259、鄭旱6號、揚粳687、綠糯米、中優188、東農425、鎮糯19號、鹽粳6號、Ⅱ優98、屜優267

（2）供試試劑：酒石酸銻鉀，KSbC4H4O7·1/2H2O，AR，上海試四赫維化工有限公司；焦銻酸鉀，K2H2Sb2O7·4H2O，AR，上海試四赫維化工有限公司；實驗過程中所使用的試劑均為分析純；去離子水。

（3）供試儀器：多功能環境培養箱（MLR-351H，三洋，日本）；原子熒光光度計（AFS-230E，北京海光儀器公司）；萊伯泰科微控數顯電熱板（EG35A Plus，浙江納德科學儀器有限公司）；高速離心機（TG16-WS，湖南凱達科學儀器有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 72 h根伸長毒性測試

選取飽滿的水稻種子，洗凈，經消毒、泡種、催芽之后，挑選根長一致的幼芽移植到500 mL裝有營養液的PVC罐中，Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）處理下的各種不同濃度均設置3個平行，每個平行中有6株幼芽，營養液是1/4強度IRRI營養液[14]，Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的暴露濃度分別為：0.00、0.31、0.61、3.07、6.14、30.69、61.38、92.07 mg·L-1和 0.00、0.51、2.54、5.08、25.38、50.78、76.17、101.55 mg·L-1等8個濃度梯度。通過HNO3和NaOH調節營養液pH到5.5。將裝有營養液和幼芽的PVC罐置于32℃培養箱中培養72 h。72 h之后拍下幼芽的照片，以Image J處理圖片測得水稻根伸長，記錄并計算根伸長的平均值、相對根伸長（Relative root elongation，RRE）。RRE計算公式為：

式中：RLT是指不同濃度Sb（Ⅲ）或Sb（Ⅴ）處理下樣品的根長，RLC是RLT對應處理下的對照組根長；RLS代表初始根長。

EC50常指半數最大效應濃度，在本實驗中表示相對根伸長RRE為50%時暴露液的濃度，EC50是定量反應Sb對水稻的脅迫能力大小的一個指標，EC50越大說明Sb的毒性越小，反之Sb的毒性越大。EC50可以根據Haanstra等定義的對數模型計算，對數模型公式如下[15]：

式中：RRE為記錄的相對根伸長或者Sb濃度通過擬合得到的相對根伸長，ɑ是表示抑制比率參數，b是相對根伸長為50%時暴露液Sb濃度的對數，x是Sb濃度的自然對數。

1.2.2 水稻根中Sb總濃度的測定

毒性暴露試驗結束后，收集水稻根，用去離子水漂洗3～4次后，所有的根都放進烘箱中，90℃殺青1 h，70℃烘干至恒質量。稱質量后置于50 mL錐形瓶中，加入適量的硝酸并放上小漏斗，放置在通風櫥中冷消解一夜。次日，進行消解，定容，用原子熒光光度計（AFS）測定[16]。Sb的檢測限是20 μg·L-1。標準樣品（GBW10015菠菜）用于質量控制，其回收率為126.67%。同時做試劑空白。

Cmax可根據Michaelis-Menten方程計算[17]，方程如下：

式中：C是水稻根中Sb的濃度，Cmax是水稻根吸收Sb的最大濃度，Kmax是最大吸收常數，x是培養液中Sb的濃度。

1.2.3 酶指標測定

經2.2.1和2.2.2實驗篩選出的紫香米、揚粳687、深兩優5183和徐旱1號作為試驗水稻，經過消毒和催芽處理后，開展根伸長抑制試驗，Sb的暴露濃度為6.09 mg·L-1。以1/4 IRRI來配制培養液，選擇根長一致的幼芽，培養72 h后將根剪下并稱鮮重，然后用破碎機進行破碎組織，離心，顯色，用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，用WST-1法測定SOD活力，用酶標儀比色法測定MDA含量[18]。

1.2.4 數據處理

根長通過ImageJ（國立健康研究所，美國）處理；根伸長計算用Excel處理；EC50半數最大效應濃度曲線和最大吸收曲線通過OriginPro 8.5擬合。采用單因素并結合多重比較法（Tukey檢驗）比較各品種之間的顯著性（P＜0.05）。本實驗所有數據均為3次重復，數據統計分析采用SPSS 20.0軟件，采用OriginPro 8.5畫圖。

2 結果與討論

2.1 不同形態的Sb對水稻根伸長的脅迫

不同形態的Sb均能抑制水稻根系的生長，且相較于Sb（Ⅴ），Sb（Ⅲ）對水稻根系形態各指標的影響比較大[19]。Sb、As為同族元素，兩者之間的性質有很多相似之處，有研究表明水稻不同品種耐As性存在差異[20]，本研究表明不同品種水稻對Sb的耐性也存在差異。不同品種水稻的EC50結果如圖1、圖2，由此可見Sb（Ⅲ）的毒性比Sb（Ⅴ）的毒性大，且不同基因型水稻對Sb的敏感性存在顯著差異（P＜0.05）（數據未列出）。如圖 1 所示，揚粳 687 的 EC50，Sb（Ⅲ）值最小為0.82 mg·L-1，表明揚粳687是對Sb（Ⅲ）的敏感品種；徐旱 1號的EC50，Sb（Ⅲ）值最大為 100.24 mg·L-1，表明徐旱1號是Sb（Ⅲ）的耐性品種，徐旱1號的EC50，Sb（Ⅲ）是揚粳687的122倍。如圖2所示，EC50，Sb（Ⅴ）最小的是深兩優5183值為13.34 mg·L-1，表明深兩優5183是Sb（Ⅴ）的敏感品種；EC50，Sb（Ⅴ）最大的是紫香米值為 776.78 mg·L-1，表明紫香米是Sb（Ⅴ）的耐性品種，紫香米的EC50，Sb（Ⅴ）是深兩優5183 的58倍。

圖1 Sb（Ⅲ）對不同品種水稻EC50的影響Figure 1 Effect of Sb（Ⅲ）on EC50of different rice

2.2 不同品種水稻根對Sb的吸收

根系是植物吸收礦物質營養和水分的主要器官，植物能夠通過減少根部與重金屬的接觸面積，從而降低對重金屬的吸收[19]。根對重金屬的吸收量在一定程度上影響整株植物對重金屬的吸收量。不同形態的Sb進入水稻的方式不同，且水稻對Sb的吸收速率也不一樣[11]。

不同品種水稻對Sb的吸收最大值也有顯著差異（P＜0.05）（數據未列出），結果如圖3和圖4所示。由圖3可見，不同品種的水稻對Sb（Ⅲ）的吸收最大值在5～12 mg·kg-1之間，敏感品種揚粳687的最大吸收值為8.43 mg·kg-1，耐性品種徐旱1號的最大吸收值為6.09 mg·kg-1。由圖4可見，水稻對Sb（Ⅴ）的最大吸收值在0.5～11.5 mg·kg-1之間，敏感品種深兩優5183的最大吸收值為1.69 mg·kg-1，耐性品種紫香米的最大吸收值為2.06 mg·kg-1。本研究結果驗證了Sb（Ⅲ）處理下的水稻根吸收Sb含量高于Sb（Ⅴ）處理的結論。

2.3 Sb的致毒機理

2.3.1 相對根伸長

重金屬對植物的發芽率、根伸長及一些根部的形態變化有一定的影響，其中根伸長的變化是植物對重金屬脅迫最直觀的指標之一。由圖5A可見，水稻在Sb（Ⅲ）處理下的相對根伸長小于Sb（Ⅴ）處理組，揚粳687、深兩優5183和紫香米在不同的Sb處理下存在顯著差異（P＜0.05），徐旱1號在不同的Sb處理下沒有顯著的差異（P＞0.05）。對照組、Sb（Ⅲ）處理組和Sb（Ⅴ）處理組徐旱1號的根伸長抑制率分別為：0、21.92%和22.86%，紫香米的根伸長抑制率分別為：0、46.75%、35.40%。

圖2 Sb（Ⅴ）對不同品種水稻EC50的影響Figure 2 Effect of Sb（Ⅴ）on EC50of different rice

圖3 Sb（Ⅲ）培養下不同品種水稻對Sb的最大吸收量Figure 3 The maximum absorption of Sb by different varieties of rice under Sb（Ⅲ）culture

2.3.2 Sb的吸收量差異

植物體內過量的Sb會影響植物的生長，5～10 mg·kg-1Sb在植物組織中會損傷植物的生長[21]。本研究結果顯示如圖5B，6.09 mg·L-1Sb處理組，水稻的根部Sb含量均小于5 mg·kg-1，表明在該濃度下植物的生長受到的損傷不嚴重。不同Sb處理的水稻根部對Sb吸收存在著顯著差異，有研究表明Sb（Ⅲ）處理組的一些植物根吸收Sb濃度大約是Sb（Ⅴ）處理組的3倍[22]。本研究的結果顯示，在Sb（Ⅲ）處理下這四種水稻根的Sb含量是Sb（Ⅴ）處理組的5倍。兩個結果之間存在偏差可能的原因有兩個：一是實驗所使用的植物不同，二是實驗所用的時間不同。

2.3.3 水稻根在Sb脅迫下超氧化物歧化酶的差異

SOD（超氧化物歧化酶）是生物體內普遍存在的酶之一，在ROS防御機制中起著關鍵的作用，它能夠降低膜脂過氧化作用，維持細胞膜的穩定性[23]。抗氧化和解毒是環境脅迫的第一道防線[24]，但增加污染物濃度可能導致這些過程的崩潰和其他相關反應的刺激[25]，SOD活力的降低表明對細胞的毒性超過細胞的極限，造成了SOD的消耗或者造成SOD瞬間保護不足[26]。研究表明外源As處理下，小于20 mg·kg-1時As濃度增加時植物體內SOD增加，說明SOD在低As條件下在保護植物方面起著重要的作用；外源As大于20 mg·kg-1時，As增加時植物體內的SOD呈減少趨勢，是植物中毒現象[27]。Chai等研究發現Sb的存在降低了苧麻（Boehmeriɑ niveɑ）中SOD含量，但存在明顯的濃度效應，40 mg·L-1的Sb顯著降低了SOD酶活性，但隨著濃度的進一步增加，SOD酶活性又顯著增加[28]。我們的研究發現 6.09 mg·L-1的 Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）處理均顯著增加了水稻根中SOD酶活性，與Sb（Ⅲ）相比，Sb（Ⅴ）處理增加更為顯著（圖6A）。

圖4 Sb（Ⅴ）培養下不同品種水稻對Sb的最大吸收量Figure 4 The maximum absorption of Sb by different varieties of rice under Sb（Ⅴ）culture

圖5 不同處理下水稻相對根伸長（A）和Sb總量（B）的比較Figure 5 The relative root elongation（A）and the concentration of rice（B）with different Sb treatments

2.3.4 水稻根在Sb脅迫下丙二醛的差異

丙二醛（MDA）是過量的活性氧指數和細胞膜脂質過氧化作用產物，可作為應激化條件下脂質過氧化狀態的指標[23]。MDA含量的增加通常表現為保護機制，消耗丙二醛對植物器官有輕微的損害[26]。As濃度的增加導致水稻根莖中MDA的增加是由于As引起的氧化壓力[27]，Sb污染使ROS誘導脂質過氧化，導致MDA的含量增加。研究結果表明（圖6B），水稻根部受到Sb的脅迫之后MDA的含量均比對照組大；且相比于Sb（Ⅴ）處理組，Sb（Ⅲ）處理組的水稻根MDA含量較大，表明水稻幼苗的生長過程中受到Sb（Ⅲ）引起的氧化壓力大于Sb（Ⅴ）引起的氧化壓力，說明該Sb（Ⅲ）對水稻根部的傷害更嚴重。

3 結論

根伸長的變化是植物對重金屬脅迫最直觀的指標之一，論文以EC50作為水稻耐Sb能力大小的篩選指標研究了Sb對水稻的生物毒性，發現Sb（Ⅲ）對水稻根伸長的毒性顯著大于Sb（Ⅴ），試驗的44種水稻品種中，揚粳687是Sb（Ⅲ）的敏感品種，徐旱1號是Sb（Ⅲ）的耐性品種；深兩優5183是Sb（Ⅴ）的敏感品種，紫香米是Sb（Ⅴ）的耐性品種。水稻對不同形態Sb的吸收差異較大，水稻對Sb的吸收量與水稻對Sb的敏感性之間沒有顯著的相關性，但是水稻對Sb（Ⅲ）的吸收顯著高于Sb（Ⅴ）。Sb顯著影響了水稻根中SOD酶活性和MDA含量，6.09 mg·L-1的Sb處理增加了水稻根中SOD酶活性，且Sb（Ⅴ）處理顯著高于Sb（Ⅲ）；Sb暴露顯著增加了水稻根中MDA含量，且Sb（Ⅲ）處理顯著高于Sb（Ⅴ），表明Sb（Ⅲ）的毒性要高于Sb（Ⅴ）。

圖6 不同Sb處理下水稻的SOD活力（A）和MDA含量（B）Figure 6 The activity of SOD（A）and the concentration of MDA（B）with different Sb treatments