辛伐他汀對全腦缺血/再灌注損傷大鼠血腦屏障的保護作用及機制研究

李偉軍

【中圖分類號】R743 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）07--01

腦缺血/再灌注損傷（CIRI）是指在腦缺血后血液恢復灌注所致的腦損傷加重現象[1]。如何防治CIRI是腦復蘇研究的熱點及難點問題。大量研究證實，CIRI與血-腦屏障（BBB）破壞密切相關，CIRI可導致BBB中ZO-1、occludin、claudin-5等細胞間緊密連接相關蛋白表達降低，從而造成緊密連接開放，BBB通透性增加，大量內毒素及炎癥細胞因子經血管壁滲入腦組織，進而加劇腦組織損傷[2]。因此，增加BBB緊密連接穩定性、阻斷BBB損傷是減輕CIRI的關鍵環節。辛伐他汀作為經典的降脂藥物，具有調節血脂、抗血栓及延緩動脈粥樣硬化等作用，并被廣泛應用于心腦血管疾病的治療[3]。近年來隨著研究的深入，辛伐他汀對腦CIRI的保護作用也日益受到關注[4]。但其防治CIRI的作用機制尚未明確。本研究旨在探討辛伐他汀對CIRI大鼠BBB損傷的保護作用，并從緊密連接相關蛋白調控水平闡明其抗CIRI的作用機制，以期為臨床提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 6周齡SPF級SD大鼠，雌雄各半，體重（250±20）g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司。動物適應性飼養1周后采用隨機數字表法對大鼠進行分組，共分為5組，即假手術組、模型組、10 mg·kg-1辛伐他汀組、20 mg·kg-1辛伐他汀組及40 mg·kg-1辛伐他汀組。

1.2 材料 辛伐他汀（海正輝瑞制藥有限公司）；ZO-1、occludin、claudin-5單克隆抗體（大連santa cruz公司）；ECL化學發光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物試劑有限公司）。

1.3 腦缺血/再灌注損傷模型建立及干預 模型組及辛伐他汀組大鼠采用Kouzumi線栓法制備大鼠腦腦缺血/再灌注損傷模型，具體操作如下：0.3ml/100 g 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，常規備皮并切開皮膚，鈍性分離左側頸總動脈、頸內動脈，微動脈夾夾閉頸內動脈，結扎左側頸總動脈近心端并做一V字型小開口，將直徑0.32～0.36 mm的尼龍魚線從剪口處順著頸內動脈方向插入，確認線栓成功插入至大腦中動脈近端后扎緊左側頸總動脈遠心端，縫合切口，插入深度約為18～20 mm，常規縫合切口。缺血2 h后將線栓緩慢拔除10 mm，使頭端撤回至頸內動脈，實現再灌注。假手術組僅游離血管，并不插入尼龍魚線，隨后縫合。再灌注后1 h，10 mg·kg-1辛伐他汀組、20 mg·kg-1辛伐他汀組、40 mg·kg-1辛伐他汀組大鼠分別灌胃10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1辛伐他汀，1次/d，連續3 d。假手術組和模型組灌胃等量生理鹽水。

1.4 神經功能損傷程度評估 再灌注后72 h，對各組大鼠進行神經功能損傷程度評估，無神經功能障礙計0分；大鼠尾巴提起后向對側前肢屈曲計1分；原地打轉，靜止時身體未偏向對側計2分；原地打轉，靜止時身體偏向對側計3分；嚴重意識障礙計4分。

1.5 腦組織水含量 再灌注后72 h，大鼠處死，取出梗死側大腦半球，稱量腦組織濕重，再將腦組織置于100℃烤箱內烘烤至恒重，后稱量腦組織干重。腦組織含水量=[（濕重-干重）/濕重]×100%。

1.6 梗死灶皮層ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表達 采用western blot法檢測梗死灶皮層ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表達。再灌注后72 h，取大鼠腦組織，常規提取組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測樣品蛋白濃度，取適量樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉至硝酸纖維膜，5%封閉液4℃封閉4 h，后分別依次加入ZO-1、occludin、claudin-5單克隆抗體（1：2000）、二抗（1：500）孵育，按ECL試劑盒說明書行電化學發光檢測。

1.7 統計學方法 采用SPSS20.0進行數據分析，計量資料用均值±標準差（Mean±SD）表示，多組間比較用one-way ANOVA檢驗，兩兩間比較用LDS-t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腦缺血/再灌注損傷程度比較 與假手術組相比較，模型組大鼠神經功能損傷評分及腦組織含水量均較假手術組顯著增高（P<0.05），10～40 mg·kg-1辛伐他汀組神經功能損傷程度及腦組織含水量均較模型組顯著降低（P<0.05）（見表1）。

2.2 各組大鼠梗死灶皮層中ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表達比較 與假手術組相比較，模型組大鼠梗死灶皮層中ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表達顯著降低（P<0.05），10～40 mg·kg-1辛伐他汀組大鼠梗死灶皮層中ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表達較模型組顯著增高（P<0.05），且呈明顯劑量依賴性（見表3、圖1）。

3 討論

BBB是指存在于腦組織和血液之間的一個復雜的生物系統，主要由細胞間緊密連接、微血管內皮細胞及連續基底膜等結構構成，其可控制血循環中某些物質向中樞神經系統的轉運，從而保持中樞神經系統內環境的相對穩定[5]。細胞間緊密連接是BBB最主要的物質結構基礎，其可通過封閉腦部微血管內皮細胞間隙，阻止細胞外水、離子和大分子物質經細胞間隙進入腦組織內部[6]。動物實驗發現，緊密連接相關蛋白與緊密連接結構穩定性密切相關，大鼠短暫性腦缺血再灌注后，BBB可通過細胞旁途徑抑制緊密連接相關蛋白ZO-1表達，導致緊密連接開放，從而增加BBB通透性[7]。本研究結果顯示，CIRI模型組大鼠神經功能損傷程度、腦組織含水量在再灌注后72h較假手術組明顯升高（P<0.05），提示CIRI可致BBB通透性增加，而這也是導致腦組織損傷加重的主要原因；同時，CIRI模型組大鼠ZO-1、occludin、claudin-5表達較假手術組明顯降低（P<0.05），其趨勢與BBB通透性改變相反。ZO-1、occludin、claudin-5均為細胞間緊密連接的重要結構蛋白，其不僅表達于緊密連接，同樣也表達于粘附連接，在緊密連接的形成及定位方面發揮重要作用，上述蛋白表達水平的高低與BBB的開放或關閉密切相關。本研究結果提示，ZO-1、occludin、claudin-5等緊密連接相關蛋白缺失是導致BBB破壞的重要環節，與國內研究結論一致[8]。

辛伐他汀屬于半合成他汀類降脂藥物，具有降血脂、保護心血管等多種藥理活性[9]。近年來動物實驗證實，辛伐他汀可通過上調Bcl-2表達、下調Bax表達，抑制神經細胞凋亡，從而發揮抗CIRI作用[10]。但辛伐他汀對CIRI所致BBB破壞的調節作用尚未可知。本研究結果顯示，辛伐他汀可顯著減輕CIRI模型大鼠神經功能損傷，同時降低BBB通透性，提示減輕BBB破壞可能是辛伐他汀發揮抗CIRI的主要機制。本研究結果顯示，CIRI模型組大鼠腦組織中ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表達較假手術組顯著增高（P<0.05），而辛伐他汀可有效拮抗CIRI所致ZO-1、occludin、claudin-5低表達，提示辛伐他汀可能是通過上調ZO-1、occludin、claudin-5表達，阻止細胞間緊密連接開放，減輕BBB破壞，從而發揮CIRI保護作用。

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