產氨細菌design—expert軟件優化浸銅實驗

李廣澤 雷丁丁 周生

摘 要：傳統微生物浸出優化方法一般為單因素實驗法和正交設計法，為了優化產氨浸銅細菌的浸出條件，基于一株高浸出率的產氨浸銅突變株，以浸出率為響應值，通過Plackett-Burman（PB）設計法篩選出影響浸出率的重要因素，通過最陡爬坡實驗接近最大響應區域，使用響應曲面分析法建立連續變量曲面模型。分析浸出率預測模型，并結合初始浸出條件獲得優化浸出條件：檸檬酸鈉：15.5g/L，pH：9.25，溫度：30.61℃，硫酸鎂：0.2g/L，磷酸二氫鈉2.1g/L，磷酸二氫鉀：1.4g/L， 搖床轉速：120r/min，接種量：20%。分別在優化浸出條件和原始浸出條件下進行浸出實驗，二者浸出率分別為：53.26%和42.71%。

關鍵詞：微生物浸出；design-expert；浸出優化

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2018.16.001

隨著礦產資源的日益緊張，低品位礦石的開采和利用越來越受到人們的關注。微生物浸礦成本低、浸礦環境溫和、綠色環保 [1]，適合處理低品位礦石，但傳統微生物浸礦菌種較單一，主要聚焦在氧化亞鐵硫桿菌（Thiobacillus ferrooxidans）的研究上[2]，其在處理硫化礦物上具有優勢，但一般無法處理其他類型的礦物，同時在處理堿性脈石礦物時，會因為堿性脈石耗酸量大而導致pH波動大，微生物生長環境難以保證。堿性微生物浸出 [3-4]可以有效解決以上問題，其浸出環境為堿性，可以避免出現脈石礦物的高耗酸，防止pH大范圍波動。高效堿性浸礦微生物的研究對于降低浸礦成本、實現綠色礦山、豐富微生物浸礦菌種具有重要意義。

浸出條件優化對提高微生物浸出率非常重要。鞏冠群等人[5]優化了氧化亞鐵硫桿菌的培養基及浸出條件，使菌株活性獲得明顯提高，最高脫硫效率達到76.2%。郭朝暉等人[6]通過正交設計和搖瓶實驗，優化了Pb/Zn冶煉廢渣中有價金屬生物浸出條件，在優化條件下，金屬Cu，Zn，In 和Ga 的浸出率分別達到95.5%，93.5%，85.0%和80.2%。通常浸出條件優化的方法為單次單因子法和正交實驗設計法，單次單因子法無法考察各因素間的交互作用，因而無法總是獲得最佳浸出條件[7]。正交實驗注重如何合理科學的安排實驗，可以找到最佳因素水平組合，但無法在整個區域上找到響應值與各因素的回歸方程，從而無法找到整個區域上因素的最佳組合[8]。響應曲面分析法實驗次數少、周期短，并且可以獲得各因素與響應值的回歸方程，從而可以擬補以往實驗方法存在的不足。本實驗在前期工作中通過紫外誘變篩選出一株高浸出率的產氨浸銅突變株，為了進一步提高其浸銅潛力，本文以浸出率為響應值，通過Plackett-Burman（PB）設計法篩選出影響浸出率的重要因素，通過最陡爬坡實驗接近最大相應區域，使用響應曲面分析法建立連續變量曲面模型，對影響浸出率的重要因素進行優化。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料

菌種：堿性產氨細菌JAT-1，經16SRNA鑒定為Providencia sp. （普羅威登斯菌屬）。

培養基成分：檸檬酸鈉：10g/L、尿素：20g/L、K2HPO4：1.4g/L、Na2HPO4：2.1g/L、MgSO40.2g/L。

初始浸出條件：溫度30℃，搖床轉速120r/min，初始pH：7，接種量20%。

礦石：礦樣為云南某礦氧化銅礦石，使用X射線衍射法對礦石進行銅物相分析，結果如表1，可以看出該礦石脈石礦物主要以硅酸鹽為主，次有碳酸鹽類及氧化物類，該銅礦石含泥量較高，為典型的難處理高堿性氧化銅礦石[9]。浸礦時采用加工至200目以下的礦樣。

1.2 實驗方法

本實驗采用室內搖瓶，取對數期的細菌按一定的接種量接種至液體培養基中，按14%礦漿濃度加入200目礦樣，于溫度可調節的恒溫氣浴振蕩器中振蕩培養。不同時刻的浸出率通過取少量浸出液，檢測銅離子濃度計算獲得，取樣后補充相同體積的新鮮培養基，以減少誤差。

2 實驗原理及方案

2.1 產氨細菌浸礦原理

Groudeva 等[10]曾使用尿素分解細菌進行過碳酸鹽型銅礦浸出實驗。研究顯示，堿性產氨菌株通過分解尿素產氨，溶液中存在微生物對脈石的侵蝕作用、氨與銅的各類礦石的絡合作用、堿性細菌的氧化還原作用、某些大分子蛋白質和胞外多聚物（EPS）的絡合作用，礦漿中主要發生的反應有：

2.2 Plackett-Burman實驗

根據前期單因素實驗，得到了影響堿性產氨細菌的浸出率可能因素，對包括A-檸檬酸鈉、B-Na2HPO4、C-KH2PO4、D-MgSO4、E-初始pH值、F-搖床轉速、G-溫度、H-接種量在內的9個因素進行考察，選用N=11的PB設計，為考慮誤差，設置3個虛擬組，每個因素取高低兩個水平，+1表示高水平、-1表示低水平。利用design-expert軟件對實驗結果進行各因素的顯著性分析，選取P<0.05的因素為主要影響因素，得到對浸出率影響最大的幾個因素。

2.3 最陡爬坡實驗

響應曲面對方程的擬合只有在所考察區域相鄰近的區域內才可以充分還原真實情況，而在其他區域內無法獲得響應曲面和擬合方程。所以，應該在最大浸出率附近區域內建立有效的響應曲面方程。本實驗根據PB實驗結論確定爬坡方向，根據各因素響應值大小確定爬坡步長。

2.4 響應曲面實驗設計

在PB實驗得到影響浸出率最顯著因素后，經過最陡爬坡實驗確定響應曲面實驗區域，以浸出率為響應指標設計實驗，得到顯著因素與響應值的等高線關系圖與曲面響應圖，并用多項式對實驗數據進行擬合得到浸出率與顯著因素的經驗模型。3因素3水平Box-Behnken設計如表2所示：

2.5 優化驗證實驗

在最佳浸出條件和原始浸出條件下分別進行實驗，驗證預測模型的準確性與浸礦優化效果。

3 實驗結果與分析

3.1 Plackett-Burman實驗及結果分析

通過表4方差分析可以看出，8個因素中有3個為顯著因素，其顯著程度為：A-檸檬酸鈉>E-pH值>G-溫度。其中檸檬酸鈉作為浸礦細菌的能源物質，起到至關重要的作用，pH值與溫度則通過影響細菌的生長，從而影響浸出率。

3.2 最陡爬坡實驗結果及分析

PB實驗擬合出浸出率與8種成分的一階方程為：

Y=-13.97292+2.39633A-0.18556B-0.31500C+0.65833D+1.94958E-0.039042F+0.59183G+0.042500H。一階模型中A、E、G的系數均為正，可以確定檸檬酸鈉、pH值和溫度的最陡爬坡方向為正，爬坡步長的確定可參考相關資料[11]。此處確定A步長為2、E的步長為1、溫度步長為5。爬坡實驗結果表5顯示，浸出率在X+3x到X+4x之間有最高點。因此，選取X+3x為之后中心組合實驗中心點。

3.3 響應曲面實驗結果及分析

圖1顯示檸檬酸鈉量與pH交互影響的響應曲面及等高線圖。由圖可知，在本實驗水平范圍內，隨著檸檬酸鈉含量的增大，浸出率隨之提高，最終達到最大值。這是因為檸檬酸鈉為浸礦細菌的能源物質，在能源物質充足時，可以保證尿素完全水解產氨，并維持細菌活性。檸檬酸鈉超量時，受細菌活性和產氨量的限制，浸出率不會再提升；當檸檬酸鈉量小于14g/L時，無論pH如何變化浸出率都無法達到最高值，當檸檬酸鈉量大于14g/L時，浸出率隨pH增大呈先升高后降低的趨勢，因此應該控制檸檬酸鈉量在14g/L以上，浸出率可以達到本實驗最高值。

圖2顯示檸檬酸鈉與溫度的交互影響及響應曲面圖，與圖1類似，檸檬酸鈉量對浸出率有決定性影響，當檸檬酸鈉量小于14g/L時無論溫度如何變化都無法達到最高值，當檸檬酸鈉量大于14g/L，溫度在27℃和33℃之間時，浸出率有最高值。

圖3顯示pH與溫度的交互影響及響應曲面圖。由圖可以看出，溫度與pH的交互作用明顯，二者存在協同作用。且在實驗水平范圍內，pH值在9～10、溫度在29～33℃時浸出率有最大值。

利用Design Expert軟件進行方差分析和二次多項回歸擬合實驗，以Y（浸出率）為響應值，以A（檸檬酸鈉），B（pH），C（溫度）為自變量，擬合得到多元二次回歸方程：

Y=-260.83752+3.08888A+29.53865B+8.25494C-0.45938AB+0.010875AC+0.22450BC+0.12951A2-1.58292B2-0.17152C2

由表7得知，模型的Prob值<0.0001，失擬項（0.0973>0.05），說明該模型回歸極顯著，失擬不顯著。模型的相關系數R2=99.47%，表明相關性很好，校正相關系數AdjR2=98.87%說明響應面98.87%的變化可以由此模型解釋，總體來說，該模型能夠較好的解釋實驗數據。

為了獲得最高浸出率，對多元回歸方程模型進行分析，存在穩定點：A=15.5，B=9.25，C=30.61，此時模型的預測值為50.8%。

3.4 回歸方程的驗證

為了檢驗模型的預測的準確性，在最佳浸出條件和原始浸出條件下分別進行實驗，所得實際的浸出率分別為53.26%和42.71%。實際浸出率與模型的預測值較接近，說明模型較好的預測了浸出情況。

4 結論

（1）采用Plackett-Bruman實驗，得到了對浸出率影響最顯著的三個因素：檸檬酸鈉，初始pH和溫度，并通過最陡爬坡實驗獲得三因素曲面響應實驗的中心點：檸檬酸鈉=13.5g/L、pH=11、溫度=35℃。

（2）采用3因素3水平曲面響應Box-Behnken設計，考察了檸檬酸鈉量、初始pH和溫度三個因素對浸出的影響，分析發現，當檸檬酸鈉大于15g/L、pH在9～10、溫度在29～33℃之間時浸出率有最大值，并獲得了浸出率預測模型。

（3）對浸出模型進行分析，并結合初始浸出條件獲得優化浸出條件：檸檬酸鈉：15.5g/L，pH：9.25，溫度：30.61℃，硫酸鎂：0.2g/L，磷酸二氫鈉2.1g/L，磷酸二氫鉀：1.4g/L， 搖床轉速：120r/min，接種量：20%。分別在優化浸出條件和原始浸出條件下進行浸出實驗，浸出率分別為：53.26%和42.71%。

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[11]Montgomery D C.實驗設計與分析[M].人民郵電出版社，2009.

作者簡介：李廣澤（1988-），男，碩士，助理采礦工程師，主要從事采礦工程、巖土力學方面的工作。