綠原酸緩解鎘暴露致大鼠腸道損傷

黃 芳，劉文惠，吳 軼，鄢雅麗，阮 征*

鎘元素于1817年被德國的化學家Strohmeier發現，關于鎘暴露最早的毒性作用觀察來自臨床醫學[1]。鎘由于其性質柔韌和良好的抗氧化性而被廣泛應用于現代工業生產中，故其對環境造成的污染日趨嚴重。鎘主要通過食物鏈、煙草煙霧以及鎘礦工業等進入人體和動物體中[2]，在體內的生物半衰期長達10～30 年，在動物和人類的血液、腎臟、肝臟、腸道、骨骼和生殖器官中不斷蓄積[3]。鎘會使肝和腎等重要器官產生嚴重的畸變和癌變[4]，被國際癌癥研究機構界定為人類致癌物。研究顯示，鎘造成的毒性與其引起機體產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）緊密相關，說明氧化應激參與鎘引起的毒性損傷。腸道是鎘進入機體的第一個器官，只有3%左右的攝入鎘可以被吸收[5]，鎘在胃腸道絨毛的最長停留時間集中在4～68 h之間[6-7]。早期的體外實驗表明腸道屏障對限制鎘的吸收至關重要[8-9]，腸道屏障被破壞會增加鎘的吸收。這些事實表明腸道是一個保護機體免受無機毒物損害的重要器官。

綠原酸（chlorogenic acid，CGA）是天然的膳食酚類物質，廣泛存在于杜仲、金銀花、咖啡與向日葵等多種植物性食品及藥食同源性食物中，是日常膳食中攝入量最多的一類酚酸[10]。早期研究表明綠原酸具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除體內自由基及免疫調節等作用，是一種重要的生物活性物質，其抗氧化作用最受關注[11-13]。綠原酸是一種酚型抗氧化劑，其抗氧化作用與其分子結構中的R—OH有關，它可以清除羥自由基和超氧陰離子自由基等，保護組織免受自由基的損害。

本實驗通過構造鎘暴露導致的腸損傷大鼠模型，添加膳食綠原酸干預，從大鼠的生長性能、組織形態學、黏膜損傷評分、絨毛高度和隱窩深度等方面來探討鎘對大鼠腸道的損傷作用，及綠原酸對鎘損傷的緩解作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級SD雌性大鼠購自長沙天勤生物技術有限公司，許可證編號：SCXK（湘）2016-0002。

綠原酸（純度98%） 阿拉丁試劑有限公司；葵花仁提取物（sunflower seed extract，SSE；含綠原酸33.27%，提取率為3.04%） 內蒙古沃禾泥農業科技有限公司；氯化鎘 西隴化工股份有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒 長沙艾杰生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

YP202N電子天平 上海精密科學儀器有限公司；SC-3614臺式離心機 科大創新股份有限公司中佳分公司；UV-160A紫外分光光度計 日本島津公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市城西曉陽電子儀器廠；BN-803生物組織攤片烤片機 湖北貝諾醫療科技有限公司；Power Tome-XL超薄切片機 美國RMC公司；RM2235切片機 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與喂養

實驗選取32 只健康SD雌性大鼠，按照隨機分配的原則分為4 組，預喂養1 周，1 周后分別對每組進行灌胃給藥。空白對照（control，CON）組：只灌胃蒸餾水；鎘損傷模型（CdCl2，Cd）組：灌胃6 mg/kg mbCdCl2；鎘損傷模型+綠原酸干預（Cd+CGA）組：灌胃6 mg/kg mbCdCl2+50 mg/kg mbCGA；鎘損傷模型+葵花仁提取物干預（Cd+SSE）組：灌胃6 mg/kg mbCdCl2+50 mg/kg mbSSE。參照GB 14924.3—2001《實驗動物 大鼠小鼠配合飼料》營養需要量配制本實驗的基礎日糧（表1）。實驗周期為14 d，之后禁食12 h后麻醉斷頭處死。

表1 飼料營養成分表Table 1 Composition and nutrients of experimental diet

1.3.2 檢測指標和方法

1.3.2.1 組織器官的采集和處理

大鼠于正式實驗第14天晚上采用麻醉斷頭的方式處死，然后解剖，分別取出內臟器官肝臟、腎臟、脾、小腸和大腸組織；小腸又分為十二指腸、空腸和回腸3 段，取出的所有器官和組織，用質量分數0.9%的生理鹽水清洗干凈并除去異物，再用吸水紙吸干后用電子天平稱質量，用以計算臟器指數，剪取部分組織用錫箔紙包好并標記，放入充滿液氮的泡沫盒中暫時保存，再用剪刀剪取空腸組織1.5 cm左右放入10%福爾馬林固定液中待用。

1.3.2.2 血樣的采集和處理

實驗大鼠采用麻醉斷頭的方式處死，收集血液，為防止所取得的血液凝固，立即4 000 r/min離心15 min，取上清液并分裝在2.5 mL的EP管中，標記后置于－80 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2.3 生長性能指標的測定

在大鼠正式造模后每7 d稱量1 次大鼠的體質量和剩余飼料質量，記錄下大鼠的體質量和進食量。計算大鼠平均每周體質量增加量和進食量情況。

1.3.2.4 臟器指數的測定

取出的肝臟、脾臟、腎臟、空腸、回腸和結腸在除去其表面或內部異物后用電子天平分別稱其質量，根據下式計算臟器指數。

式中：m1為器官質量/g；m2為大鼠體質量/kg。

1.3.2.5 血液生化指標的測定

取存于－80 ℃冰箱中的血清200 μL放入全自動生化分析儀中，并加入檢測試劑測定谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活力及血清白蛋白（serum albumin，ALB）水平。

1.3.2.6 腸道黏膜HE染色

所取空腸樣本采用10%福爾馬林溶液固定、乙醇逐級脫水、二甲苯透明處理、石蠟包埋，切片并做HE染色[14]，在電子顯微鏡下觀察組織的損傷切片。用ISCpicture 3.0系統進行圖像采集，收集放大200 倍條件下觀察到的圖片，采用顯微圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0測量空腸絨毛高度和隱窩深度。絨毛高度是從腸絨毛基部至絨毛頂端的長度，隱窩深度是從腸腺絨毛聯結處至腸腺基部的距離。收集數據，做后續統計學分析。

1.3.2.7 腸道的評分

腸道病理損傷程度的評價采用Chiu氏評分法[15]。0 分：正常腸黏膜；1 分：絨毛頂部出現上皮下間隙；2 分：上皮下間隙繼續擴展；3 分：上皮層大塊分離伴部分絨毛頂部缺失；4 分：絨毛消失伴固有層、擴張的毛細血管裸露；5 分：固有層潰瘍、解體。

1.4 數據統計分析

將經過初步處理后的數據用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析以及Tukey氏多重比較，最終結果以 ±s表示，以P＜0.05為差異顯著性的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 綠原酸對鎘暴露大鼠生長性能的影響

表2 綠原酸對鎘暴露大鼠體質量和進食量的影響（n＝8）Table 2 Effect of chlorogenic acid on body mass and feed intake of rats with cadmium exposure (n= 8)

由表2可知，鎘損傷造模1 周后，造模組第一周的體質量增加量和進食量與空白對照組相比均無顯著性差異，綠原酸干預1 周后，Cd+CGA組第一周的體質量增加量、進食量與模型組相比也無顯著性差異。鎘損傷造模2 周后，與空白對照組相比，Cd組的體質量增加量和進食量顯著降低（P＜0.05）；與Cd組相比，Cd+CGA組的體質量增加量與進食量顯著增加（P＜0.05），Cd+SSE的體質量增加量與進食量也顯著增加（P＜0.05）。

表3 綠原酸對鎘暴露大鼠臟器指數的影響（n＝8）Table 3 Effect of chlorogenic acid on organ indexes of rats with cadmium exposure (n= 8)

由表3可知，重金屬鎘損傷造模2 周后肝臟指數較空白對照組、Cd+CGA組和SSE+CGA組顯著降低（P＜0.05）；腎臟指數也較空白對照組和Cd+CGA組顯著降低（P＜0.05）；空腸指數較空白對照組和Cd+CGA組顯著升高（P＜0.05）；回腸指數較空白對照組、Cd+CGA組和Cd+SSE組顯著升高（P＜0.05）。

2.2 綠原酸對鎘暴露大鼠血液生化指標的影響

由表4可以看出，重金屬鎘損傷造模2 周后，血液中ALT活力較空白對照組、Cd+CGA組和Cd+SSE組顯著升高（P＜0.05），AST活力較空白對照組、Cd+CGA組和Cd+SSE組也顯著升高（P＜0.05），ALB的水平則較其他組均無顯著性變化。

表4 綠原酸對鎘暴露大鼠血液生化指標的影響（n＝8）Table 4 Effect of chlorogenic acid on blood biochemical indicators of rats with cadmium exposure (n= 8)

2.3 綠原酸對鎘暴露大鼠腸道黏膜形態的影響

圖1 大鼠空腸黏膜形態（200×）Fig. 1 Mucosal morphology of rat jejunum (200 ×)

圖2 大鼠空腸絨毛高度（A）及隱窩深度（B）Fig. 2 Jejunum villus height (A) and crypt depth (B) in rats

空白對照組大鼠空腸黏膜的形態基本正常，腸黏膜絨毛結構完整，絨毛排列整齊，上皮細胞排列整齊，間質無水腫（圖1A）；Cd組大鼠空腸黏膜絨毛完整性被破壞，絨毛間質疏松，腸絨毛排列極不規則，絨毛上皮壞死脫落，上皮層與固有層可見分離，固有層出現水腫（圖1B）；Cd+CGA組大鼠空腸黏膜形態基本正常，腸黏膜絨毛結構比較完整，絨毛排列較造模組整齊，間質無明顯水腫（圖1C、D）。由圖2A、B可以看出Cd組大鼠的絨毛高度和隱窩深度較空白對照組顯著降低（P＜0.05），Cd+CGA組和Cd+SSE組較Cd組絨毛高度和隱窩深度顯著升高（P＜0.05）。

2.4 腸道評分

圖3 大鼠空腸評分Fig. 3 Jejunum mucosal injury scores

Chiu氏評分法的結果見圖3，此評分體系中，得分越高組表明腸道黏膜損傷越嚴重。空白對照組平均評分為0.75；Cd組平均評分為4，表明腸黏膜損傷很嚴重；Cd+CGA組平均評分為2.13，表明腸黏膜損傷較造模組得到了一定程度的改善；Cd+SSE組平均評分為2.38，表明腸黏膜損傷較造模組也得到了一定程度的改善。

3 討 論

生長性能是反映機體動物生長和營養狀態的比較直觀的指標。鎘進入機體后會在機體內大量蓄積，進而產生一系列毒性反應，會嚴重影響生長期動物的食欲，從而使體質量增加量受到影響。王靜[16]研究發現，與對照組相比，染鎘組能顯著降低小鼠日平均增長體質量，添加花青素可顯著增加染鎘大鼠的體質量；Shim等[17]研究發現染鎘組日平均采食量與對照組相比顯著下降，添加小球藻粉末后可顯著使采食量增加；歐陽彩群[18]研究發現染鎘組大鼠肝臟指數與對照組相比存在顯著性差異；王林[19]研究發現染鎘組大鼠腎臟指數與對照組相比有顯著性差異，這些結論與本實驗得出的結果一致。腸道是鎘進入機體途經的第一個器官，在腸道產生大量活性氧，這些自由基會使腸道上皮結構被破壞，細胞產生水腫。結腸指數無顯著性差異的可能原因是鎘主要在小腸段被吸收，對結腸的損傷相對較小[20]。

肝功能是由肝酶標記的等離子體（ALT和AST）決定的，Abdel-Rahim等[21]研究發現染鎘組大鼠可顯著刺激ALT和AST等離子體大量生成，這意味著鎘抑制了肝的活性，添加龍葵汁可顯著降低鎘引起的ALT和AST的增加量，這與本實驗結果是一致的。說明綠原酸能顯著抑制染鎘大鼠ALT和AST的大量合成，保護肝臟功能，降低鎘的毒性。

本實驗觀察的腸道黏膜形態與Zhao Zhaohui等[22]的研究結果是一致的。鎘暴露會使線粒體腫脹，從而使吸收細胞壞死[23]。從死細胞中釋放的細胞碎片或者酶可能傷害或者殺死相鄰的完整的細胞，從而放大鎘的毒性[24]。染鎘后大鼠腸道結構的完整性遭到破壞，腸道絨毛高度降低，絨毛脫落，會減少腸道內表面營養物質的吸收面積，直接影響著動物生長發育。同時絨毛高度與上皮細胞數量呈正相關，只有成熟的腸道絨毛上皮細胞才有吸收養分的功能。因此大鼠染鎘后絨毛高度降低，會使成熟的絨毛上皮細胞減少，則其養分吸收能力會降低[25-27]。本實驗結果表明綠原酸可顯著增加染鎘大鼠腸道絨毛的高度。小腸隱窩是絨毛根部的上皮陷入固有層而形成的管狀腺。隱窩深度主要是反映腸道上皮細胞的生成率。隱窩變淺時，成熟的細胞生成量會降低，分泌能力減弱，消化液的分泌隨之減弱，腸道吸收功能則也會減弱[28]。本實驗結果顯示染鎘大鼠隱窩深度較空白對照組顯著降低，使上皮細胞生成率下降，影響營養物質的吸收，而添加綠原酸可顯著使染鎘大鼠隱窩變深。

本實驗的研究結果表明，綠原酸可以改善染鎘大鼠腸道黏膜損傷，增加絨毛高度和隱窩深度，從一定程度上增加體質量增加量和進食量，緩解器官指數失衡，能顯著抑制鎘造成的ALT和AST大量合成，保護大鼠肝臟功能，降低鎘的毒性作用。