腺苷酸活化蛋白激酶活性及其級聯效應對肉品品質的影響研究進展

王 宇，袁 倩，王柏輝，楊 蕾，趙麗華，靳 燁*

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一個異源三聚體，普遍存在于真核細胞生物中，由一個催化亞基α和兩個調節亞基β和γ構成[1]。α亞基含有催化結構域（kinase domain，KD）和自動抑制結構域（auto-inhibitory domain，AID），且有兩種異構體，α1在機體中分布廣泛，定位于細胞質，而α2主要存在于骨骼肌、心臟和肝臟中，定位于細胞核[2]；β亞基有兩種亞型，β1在肝臟中表達，而β2在骨骼肌中表達；γ亞基上有和腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結合的位點，其有3 種亞型，γ1和γ2在機體中分布廣泛，而γ3只在骨骼肌中表達[3]。細胞中的分解代謝和合成代謝共同決定細胞的能量狀態，AMP是細胞能量狀態的關鍵檢測器，而AMPK是細胞中AMP的主要分子傳感器。因此，AMPK的活性主要由AMP與ATP的比值調控，機體在應激狀態下消耗ATP導致AMP與ATP比值增大，從而激活AMPK，磷酸化的AMPK（phosphorylated AMPK，P-AMPK）激活AMPK的級聯效應，參與調控機體的能量代謝，上調產能分解代謝，關閉耗能代謝途徑[4]。AMPK通過調控下游靶蛋白和控制誘導基因轉錄修飾的轉錄因子和共激活劑的活性，調節細胞的能量代謝[5]，進而反映細胞能量水平以及特定細胞外營養物質的變化，如葡萄糖、脂肪酸、瘦素（Leptin）、脂聯素（adiponectin，AdipoQ）和生長素，從而有助于控制機體的能量平衡和食物攝入量[6]。因此，深入研究AMPK的生物學特性對提高畜禽肉品品質有重要的意義。

1 AMPK活力的調節

如同其他激酶，AMPK同樣通過磷酸化其活化環上的Thr172位點使其活化。AMPK無活性時，AID結合到KD上，抑制AMPKα Thr172的磷酸化；而當游離的AMP結合到AMPKγ上時，導致AID從KD上解離，解除了AID對AMPKα Thr172位點磷酸化的抑制作用，且降低了磷酸化酶（protein phosphatase 2C，PP2C）對AMPKα Thr172位點去磷酸化作用，使Thr172仍處于磷酸化狀態，間接激活AMPK[7]。目前發現3 種主要的AMPK上游激酶（AMP-activated protein kinase kinase，AMPKK），均通過磷酸化AMPKα Thr172位點使其活化[2]。據報道，5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖苷酸（5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside，AICAR）、AdipoQ、Leptin等物質均可調控AMPK活力。

1.1 上游激酶對AMPK活力的調節

抑癌肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）又名STK11，是AMPK主要的上游激酶。當機體遭受饑餓、缺血、缺氧、藥物等應激時，LKB1會優先激活AMPK保護機體。LKB1具有活性的必要條件是與兩個附屬蛋白——STE20相關銜接蛋白（STE20 related adaptor protein，STRAD）和小鼠蛋白25（mouse protein 25，MO25）形成復合物[8]。STRAD是LKB1的特異性接頭蛋白和底物，MO25的主要作用是連接到STRAD羧基端維持STRAD和LKB1復合物的穩定性[7]。AMP結合AMPK使其成為LKB1復合物的優質底物，不僅增強了LKB1對AMPK的磷酸化程度，而且降低了PP2C對AMPK的去磷酸化程度，從而激活AMPK[9]。Lin Ruiting等[10]的研究表明，6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶使細胞內5-磷酸核酮糖達到生理水平后抑制了LKB1-AMPK信號通路，進而促進脂肪酸的合成。

鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶（calcium-calmodulin dependent protein kinase kinase，CaMKK）也可調控AMPK的活性。當機體細胞漿中游離鈣的濃度升高時，CaMKK將高靈敏地感受到Ca2+濃度變化而被激活[11]。在不改變AMP與ATP比值的情況下，相比于CaMKKα，CaMKKβ磷酸化AMPK的Thr172位點以激活AMPK的速度更快[12]。研究表明雷公藤甲素通過激活CaMKK-AMPK信號通路誘導癌細胞的自噬，如果敲除CaMKK基因或用特異性抑制劑sto-609抑制CaMKK的活性后，會導致癌細胞中AMPK Thr172位點的磷酸化水平降低，進而抑制雷公藤甲素誘導癌細胞的自噬[13]。

轉化生長因子β活化蛋白激酶1（transforming growth factor-β activated kinase，TAK1）是絲裂原活化蛋白激酶的成員，在AMPK活性調節中起重要作用[14]。Wang Bing等[15]的研究表明，一種新型組蛋白去乙酰化酶抑制劑Belinostat能提高胰腺癌細胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生，但ROS只有在TAK1活性的介導下才可激活AMPK下游的信號級聯反應，TAK1的活性被抑制會明顯抑制ROS對AMPK的激活作用。

1.2 AMP途徑調節

5’-AMP可變構激活AMPK（高達10 倍），ATP和AMP具有相似的結構，兩者可競爭性結合AMPK的變構位點[16]。細胞中AMP主要來源于腺苷酸激酶反應：2腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）?ATP+AMP。當機體處于靜息狀態下，ATP與ADP的比值維持在較高水平，反應逆向進行，所以低含量的AMP無法激活AMPK；但當機體遭受應激消耗ATP時，反應正向進行，導致AMP大幅度增加，從而特異性激活AMPK[1]。AMP通過3 種方式激活AMPK：AMP變構激活AMPKK；AMP結合到AMPK上，使其成為蛋白磷酸酶較差的底物，同時成為AMPKK的優質底物；AMP變構激活AMPK[17]。另外據報道，ADP可提高AMPK Thr172位點的磷酸化程度，但前提是AMPK的β亞基N末端豆蔻?；痆18]。

AICAR是AMPK常用的激活劑。AICAR能激活對AMP敏感的酶，如AMPK、糖原磷酸化酶和果糖-1,6-二磷酸酶，所以AICAR不是AMPK的特異性激活劑[19]。機體攝入AICAR后，經細胞腺苷激酶磷酸化為單磷酸核苷（D-ribofuranosyl-5-monophate，ZMP），ZMP與AMP具有高度的相似性，也可以結合AMPK的變構位點激活AMPK，且兩者的作用具有加和性[20]。

1.3 AMP非依賴途徑調節

AdipoQ是脂肪組織分泌的一種細胞因子，主要通過與兩種受體AdipoQR1和AdipoQR2結合發揮其生物作用，AdipoQR1在組織中表達廣泛，而AdipoQR2主要存在于肝細胞中[21]。研究表明，AdipoQ結合AdipoQR1后會磷酸化LKB1使其活化，活化的LKB1通過磷酸化AMPKα的Thr172位點激活AMPK[22]。Awazawa等[23]的研究表明AdipoQ通過結合AdipoQR1激活AMPK，從而抑制固醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins，SREBP）1c的表達，減少脂肪酸合成。

Leptin是脂肪細胞因子家族中的一員，主要由脂肪細胞分泌，它的循環水平和機體的脂肪量成正比[24]。Leptin與跨膜受體lepR結合使LKB1活化，活化的LKB1則從胞核轉移到胞質中，磷酸化AMPK的Thr172位點激活AMPK[25]。García-Carrizo等[24]的研究表明，Leptin對AMPK僅在短時間內具有激活作用，隨后的6～12 h期間AMPK的磷酸化水平顯著下降。有研究表明，Leptin通過磷酸化下丘腦中AMPKα的Ser491位點抑制AMPKα2的活性，通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）-腫瘤抑制蛋白結節性硬化復合物（tuberous-sclerosis complex，TSC）-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路激活70S核糖體S6蛋白激酶（p70 ribosomal protein S6 kinases，p70S6K），而p70S6K通過磷酸化AMPKα的Ser491位點抑制AMPKα2的活性，導致體質量下降和食欲降低[26]，AMPK也可抑制p70S6K的活性進而抑制蛋白質的合成。

8Br-AMP和復合物C（Compound C）是AMPK常用的抑制劑，在不改變細胞AMP與ATP比值條件下，均可抑制AMPK的活性及其下游的級聯反應，但具體的作用機制需進一步研究。

2 AMPK級聯效應

圖1 AMPK級聯效應示意圖Fig. 1 Schematic diagram of AMPK cascade

如圖1所示，AMPK級聯效應由AMPK及其下游的一系列靶點基因構成，一旦AMPK活化將磷酸化/去磷酸化其直屬下游靶點，激活或抑制直屬下游靶點的活性，直屬下游靶點再聯動地激活或抑制各自的下游靶點，進而激活AMPK的級聯效應，參與調控機體的能量代謝，如糖代謝、脂代謝、蛋白代謝。AMPK主要通過激活或抑制PGC-1α和FOXO1基因，聯動地調控GLUT4、G6Pase等下游靶點，參與調控機體糖代謝，進而影響肉品的pH值、色澤和持水性等指標；通過激活或抑制PGC-1α和SREBPs基因，聯動地調控PPARs、ACC和FAS等下游靶點，參與調控機體脂代謝，進而影響肉品的風味、嫩度、多汁性、色澤和系水力等指標；通過抑制TSC基因級聯地調控mTORC1和eEF2K下游靶點，參與調控機體蛋白代謝，進而影響肉品的色澤。

3 AMPK對肉品品質的影響

圖2 AMPK是能量代謝的主要調控器Fig. 2 AMPK is a major regulator of energy metabolism

3.1 AMPK通過調節糖代謝影響肉品品質

靜息狀態下，機體中葡萄糖的產生與葡萄糖的攝取處于一定的動態平衡，但當外界因素（運動、饑餓、缺血、藥物、細胞因子等）刺激機體時導致整個動態過程失衡并激活AMPK，P-AMPK主要通過以下3 種方式調節糖代謝：促進GLUT4轉位、上調GLUT4基因的表達；加速糖酵解；減少糖原合成和糖異生。

P-AMPK不僅可以磷酸化Rab10的TBC1域家族成員TBC1D1的Ser231位點和TBC1D4的Ser704位點使它們被激活，進而調節GLUT4的囊泡與細胞膜的融合和?？?，增強GLUT4轉位[27]，還能減少心肌細胞內吞GLUT4，即增加細胞膜上GLUT4的含量，增加葡萄糖轉運量[7]。P-AMPK通過磷酸化激活PGC-1α，而活化的PGC-1α再激活轉錄因子MEF2，促使MEF2向細胞核內轉移并與GLUT4增強子結合，上調GLUT4基因表達，促進糖原轉運[28]。P-AMPK通過直接磷酸化糖酵解關鍵酶（HK、PFK2等）或上調糖酵解酶的基因表達激活它們，進而加速機體糖酵解，促進ATP的合成[29]。Liang Junfang等[30]的研究表明，AMPKα2敲除的小鼠（而不是AMPKα1敲除的小鼠）降低了死后肌肉中AMPK的活性，且減少了宰后肉pH值的下降和乳酸的生成，所以AMPKα2催化亞基是宰后肌肉糖酵解主要的調節者。P-AMPK通過直接磷酸化GS的Ser7位點使其失活，減少糖原合成[18]。P-AMPK不僅可以直接磷酸化TORC2的Ser171位點使其失活，還可以直接磷酸化FOXO1使其失活，但不能進入核內與cAMP應答元件結合蛋白（cAMP-responseelement-binding protein，CREB）結合抑制糖異生[31]，也不能激活糖異生限速酶（PEPCK和G6Pase），進而抑制糖異生[32]。研究表明PGC-1α可誘導糖異生，但由于TORC2被AMPK磷酸化而失活，中斷了PGC-1α-TORC2信號通路，抑制了糖異生[28]。

畜禽屠宰前，耐力運動或攝入特殊營養物質（L-精氨酸）可激活AMPK，提高骨骼肌糖原含量，進而增強肌肉強度[33]。而畜禽屠宰后，肌肉及各細胞內的生物化學反應仍在繼續進行，但由于失血導致體液平衡被破壞、供氧停止，機體很快進入無氧狀態，ATP含量迅速降低，激活AMPK，加速糖酵解途徑使乳酸蓄積，導致pH值快速降低，而糖酵解產生的熱量減慢了胴體的冷卻，故高溫和低pH值易導致形成PSE（pale，soft，exudative）肉。宰后肉AMPK活力的高低會直接影響pH值下降的快慢，進而影響肉品的色澤、持水性等指標。研究表明長期處在饑餓壓力下的西藏綿羊，宰后肉的AMPK活力和乳酸含量增加、糖原含量減少、pH值降低、熟肉率降低、滴水損失減少、剪切力增加[34]。宰前運輸加速機體ATP消耗，放血后肌肉的低能量狀態致使AMPK快速被激活，導致糖酵解迅速發生、乳酸積聚和PSE肉的形成率增加[35]，而運輸后休息期間的水淋浴噴霧可緩解宰前應激并恢復畜禽能量，緩解了宰后肉質的惡化。Hu等[36]的研究表明在急性熱應激條件下，通過膳食中補充谷氨酰胺或葡萄糖均可提高雞胸肉的pH值、a*值和b*值，降低滴水損失、L*值和AMPK的活性。

3.2 AMPK通過調節脂代謝影響肉品品質

ACC是脂肪酸合成的限速酶，有ACCα和ACCβ兩種亞型，ACCα主要在脂肪酸合成的組織中表達，如肝臟和脂肪組織，ACCβ主要在脂肪酸氧化的組織中表達，如骨骼肌和心肌[1]。P-AMPK通過磷酸化ACCβ的Ser221位點使其失活，抑制了ACC將乙酰輔酶羧化為丙二酰單酰輔酶A（malonyl-CoA，MCA）的催化作用，降低了MCA對CTP1的抑制作用[7]，從而使線粒體外膜上的跨膜蛋白CTP1可催化長鏈脂肪酸轉運到線粒體基質中進行β氧化供能。P-AMPK也可激活MCD，導致MCA含量降低，加速脂肪酸氧化[37]。研究表明，P-AMPK先激活PPARα的輔助活因子PGC1，促進PPARα和PGC1結合進而上調PPARα的表達，活化的PPARα可上調下游靶點CPT1和MCAD等脂肪酸β氧化的限速酶活力，從而增加脂肪酸氧化供能[38]。

P-AMPK不僅可以磷酸化HMGR的Ser871位點使其失活，降低膽固醇合成，也可以抑制其下游靶點過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）和GPAT的活性，減少脂肪細胞中甘油三酯的積累[39]。SREBPs能調控機體脂肪酸和甘油三酯的合成，當機體膽固醇含量低時，SREBP裂解激活蛋白會與SREBP1c結合將其送入高爾基體內進行修飾，暴露出活性部位，之后進入核內調節下游靶點ACC、SCD1和FAS等酶的活力，促進脂肪酸生成[40]。研究表明，mTORC1也可激活SREBP1c，導致其發生核轉移并參與調節靶基因的后續轉錄，促進脂肪酸生成[41]。而P-AMPK通過直接磷酸化SREBP1c，降低其轉錄活性、與DNA結合的能力及進入核內的數量，從而減少脂肪酸合成[42]。研究表明SCD1基因的突變或缺失可激活AMPK，增加脂肪酸氧化[43]。P-AMPK還可抑制SREBP2對其下游靶標HMGR的調控，降低膽固醇的含量[44]。

當脂肪分解速率高于脂肪酸利用率時，會導致脂肪再次從頭合成，為防止ATP消耗，P-AMPK會磷酸化HSL的Ser565位點，進而阻止HSL的Ser563位點被環腺苷酸依賴cAMP的蛋白激酶磷酸化激活，最終降低脂肪的分解[45]。

SIRT1和AMPK均能調控脂類代謝。研究表明SIRT1可被酚類物質激活，活化的SIRT1會激活LKB1和AMPK引起ACC磷酸化失活，從而參與脂質代謝調控[46]。AMPK和SIRT1協同調控骨骼肌能量代謝相關基因的表達，P-AMPK間接地通過增加細胞內NAD+/NADH激活SIRT1，從而促進其下游靶基因（如PGC-1α、CTP1、丙酮酸脫氫酶激酶4基因（pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4，PDK4）、GLUT4）的表達，反過來SIRT1可對LKB1去乙?；蛊浠罨罨腖KB1再磷酸化AMPK的Thr172位點激活AMPK[47]。Lin Jiandie等[48]的研究表明PGC-1α基因與肌纖維的轉化密切相關，PGC-1α基因的過表達會提高骨骼肌中I型肌纖維的含量。AMPK經外界刺激激活使細胞中NAD+/NADH增加，激活SIRT1，活化的SIRT1可介導下游靶點PGC-1α發生去乙酰化被激活，P-AMPK也可直接磷酸化PGC-1α的Thr177和Ser538位點以激活PGC-1α[49]，活化的PGC-1α通過調控其下游靶基因MEF2和Nrf1的活性，促進I型肌纖維形成[2]。MEF2也可直接與PGC-1α基因的啟動子結合調控PGC-1α的表達，進而調控肌纖維類型的轉化[2]。

Cantó等[50]的研究表明SIRT1和PGC-1α的脫乙酰對AMPK增加PGC-1α的活性是必要的，抑制SIRT1活性會降低AICAR對PGC-1α脫乙酰的誘導作用，AMPK調節線粒體和脂質代謝相關基因的表達時，很大程度上需要依靠SIRT1對PGC-1α活力的調控。據報道，monacolin K通過SIRT1-AMPK信號通路使FOXO1脫乙?；?去磷酸化被激活，活化的FOXO1由細胞質定位轉變為核定位，激活了脂質分解的限速酶ATGL，促進甘油三酯分解為甘油和游離脂肪酸[51]。研究表明，AMPK通過磷酸化ATGL的Ser406位點，增加了甘油三酯的分解[52]。monacolin K還可通過SIRT1-AMPK信號通路磷酸化SREBP1，抑制SREBP1進入細胞核發揮脂肪合成作用[51]。一些研究表明SIRT1與AMPK相互作用，共同調控脂質代謝，但兩者信號間的轉導關系仍需深入研究。

在畜禽飼養期間，通過外界刺激激活畜禽體內的AMPK，一方面導致酵解型肌纖維向氧化型肌纖維轉變，使機體中氧化型肌纖維含量增加，肌纖維的類型決定肉的性能和品質，肌纖維類型組成不同，肉的嫩度、肌內脂肪（intramuscular fat，IMF）含量、肌肉色澤和風味等肉品指標也有差異。若酵解型肌纖維所占比例大，則宰后肉pH值下降迅速且系水力低，易形成PSE肉。反之，氧化型肌纖維所占比例大，則肌肉嫩度好、pH值下降緩慢、色澤紅潤、風味好、肌紅蛋白和磷脂的含量也豐富。Huang等[53]的研究表明，氧化型肌纖維含量與背膘厚度和IMF含量呈正相關，而酵解型肌纖維含量與IMF含量呈負相關，與屠宰率呈正相關。另一方面，AMPK可抑制脂肪生成，影響畜禽的肌內脂肪沉積量，進而影響肉質嫩度和多汁性。Shen等[54]的研究表明小鼠膳食中補充α-硫辛酸可提高小鼠死后肌肉的極限pH值，減少胴體脂肪的沉積，并可防止PSE肉的形成。Yang Ye等[55]的研究表明，慢速型生長雞16 周后肌內脂肪含量和脂肪基因表達明顯高于8 周快速生長雞，且16 周慢速生長雞的AMPK表達顯著低于8 周快速生長雞，所以AMPK表達與雞的IMF含量呈負相關。王亞娜等[56]的研究表明，宰后肉在成熟過程中脂肪氧化和降解產生的醛、醇、酮等風味物質會對肉的風味有一定影響。宰后肉經烹飪處理產生的揮發性支鏈脂肪酸和烷基酚類也會影響肉品的風味。

3.3 AMPK通過調節蛋白代謝影響肉品品質

mTOR是調控機體蛋白質合成的重要樞紐，mTOR發揮功能的必要條件是存在mTORC1或mTORC2。P-AMPK直接磷酸化TSC2的Ser1345位點，激活TSC1/TSC2復合物，抑制小G蛋白的活性，使mTOR失活[57]。4EBP1和p70S6K是mTORC1下游蛋白，4EBP1調控蛋白的翻譯，而p70S6K調控蛋白的合成。mTORC1通過磷酸化4EBP1使真核細胞啟動因子（eukaryotic initiation factor，eIF）4E從4EBP1-eIF4E復合物上解離下來，游離的eIF4E與eIF4G、eIF4B、eIF4A結合形成eIF4F起始復合物，再結合到5’ TOP mRNAs結構上啟動機體蛋白質的翻譯[58]。p70S6K基因被mTORC1磷酸化形成了具有活性的P-p70S6K，促進蛋白質的合成[59]。mTOR經P-AMPK作用失去活性，降低其對4EBP1和p70S6K的磷酸化作用，從而抑制機體蛋白質的合成。

eEF-2主要調控機體蛋白質的翻譯、肽鏈的延伸和核糖體的移動等。P-AMPK通過磷酸化eEF2K的Ser398位點改變eEF2K的活性[60]。活化的eEF2K通過磷酸化eEF-2的Thr56位點使其失活，減少了eEF-2與核糖體間的相互作用，降低蛋白質的合成[61]。研究表明mTORC1-p70S6K信號通路通過磷酸化eEF2K的Ser366位點抑制了eEF2K的活性[62]。

AMPK活性的改變可能導致mTOR信號的改變，并會影響畜禽瘦肉的生長[63]。機體運動時AMPK被激活，抑制蛋白質的合成，但運動后的恢復期，AMPK對蛋白質的抑制減弱，機體會提高蛋白質的合成以補充運動中流失的蛋白質[47]。Dreyer等[64]的研究表明，運動期間P-AMPK降低了4EBP1的磷酸化，進而抑制蛋白質的合成，但運動后1～2 h Akt、mTOR、S6激酶、eEF2等的活化提高了蛋白質的合成；因此可通過增加畜禽的運動量提高AMPK活性，增加運動后期蛋白質的合成，如增加肌紅蛋白的含量以提高肉的色澤、增加一些肌纖維蛋白的合成以增強肌肉的強度。Appuhamy等[65]的研究表明，P-AMPK對牛乳腺上皮細胞中mTOR介導的蛋白質合成具有負向調控作用，但與mTOR介導的乳蛋白合成相比，其對乳蛋白合成速率的影響甚微。

4 結 語

AMPK及其級聯效應可調控機體的各種能量代謝，如促進糖酵解、葡萄糖吸收、脂肪酸氧化和I型肌纖維形成，并抑制糖原、脂肪酸、膽固醇、蛋白質等物質的合成。所以，調控AMPK的生物學效應將有利于肉品品質的改善。到目前為止，國內外主要是將AMPK作為許多慢性代謝疾病的治療靶點，如糖尿病、肥胖、癌癥和腫瘤等，而通過調控AMPK改善肉品品質的研究相對較少。但由于AMPK是機體糖脂蛋白代謝的重要調節器，宰前AMPK主要通過調節脂代謝和蛋白代謝影響機體脂肪沉積、肌纖維類型及蛋白質的合成，進而影響肉品品質，而宰后其主要通過調控糖酵解影響肉品品質。因此，AMPK及其級聯效應仍是改善肉品品質的重要靶點。