苦蕎D-手性肌醇提取物抑制NOX4活性及提高血管舒張作用

張波波，高彩鳳，李云龍，王 敏,*

內皮功能紊亂是血管形態及結構損傷的病理基礎[1]，也是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等多種疾病發生的早期環節[2-3]，且預防內皮功能紊亂是預防或治療相關代謝性疾病的有效手段[4-5]。大量研究顯示，高脂飲食導致的脂代謝紊亂，尤其是血清中過高游離脂肪酸引起的氧化應激是導致內皮功能紊亂的主要原因之一[6-8]。

NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）介導的活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一種“kindling radicals”，能夠引起其他途徑ROS的大量產生，如黃嘌呤氧化酶及一氧化氮合酶[9-10]。NOX家族共有7 個成員，其中NOX1、NOX2、NOX4、NOX5等亞型大量表達于內皮細胞中[11-12]，然而NOX4在內皮細胞中具有最高的表達量[13-14]，在引起內皮功能障礙及動脈粥樣硬化中有關鍵作用[15]。說明抑制NOX4是減輕或預防內皮功能紊亂的重要策略。

苦蕎具有預防心血管疾病、糖尿病等功效[16-17]，究其原因很可能是其生物活性物質保護內皮功能起效。苦蕎除富含淀粉、蛋白、多酚、黃酮外，還富含D-手性肌醇（D-chiro inositol，DCI）[18]。DCI是機體自身存在的物質，在以內皮功能紊亂為主要特征的糖尿病、多囊卵巢綜合征等患者體內嚴重缺乏[19-20]，且補充DCI能顯著改善高血壓或糖尿病狀態下內皮氧化應激及功能紊亂[21-22]。但是DCI是否同樣能減輕非糖尿病等疾病狀態，如高脂刺激下內皮功能障礙，且DCI保護內皮功能的作用機制尚不明確，因此本實驗通過考察高脂及苦蕎麩皮提取物（tartary buckwheat bran extract，TBBE）對體外內皮細胞、離體血管、在體動物血管中NOX4活性的影響，觀察對血管內皮依賴性舒張的改變作用。探討提取物在高脂狀態下對內皮功能的保護作用，為苦蕎等富含DCI食物的有效利用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級體質量200～250 g左右的SD大鼠及雄性5～6 周齡的ICR小鼠，飼養于中國藥科大學中藥藥理教研室SPF級動物室（許可證號：SCXK（Su）2012-0004）。高脂飼料由質量分數（下同）0.2%膽鹽、1%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃、78.8%基礎飼料組成。

TBBE（含35.7 g/100 g水、33.5 g/100 g DCI、0.33 g/100 g蘆丁，未檢測到槲皮素（＜0.02 g/100 g）），由山西農業科學院農產品加工研究所提供。

二苯基氯化碘鹽（diphenyleneiodonium chloride，DPI）、乙酰膽堿 美國Sigma公司；苯腎上腺素 TCI（上海）化成工業公司；棕櫚酸（palmitic acid，PA）國藥集團化學試劑有限公司；MTT、DCFH-DA探針碧云天生物技術研究所；Anti-NOX4 德國Abcam公司；游離脂肪酸（free fatty acids，FFAs）試劑盒、血糖試劑盒 南京檢測生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

熒光酶標儀及細胞培養箱 美國賽默飛公司；超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；倒置生物顯微鏡重慶光學儀器廠；穩壓穩流電泳儀 南京科寶儀器研究所；轉膜儀及垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；離體組織器官恒溫灌流系統、生物機能實驗系統 成都臺盟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 內皮原代細胞的提取及培養

參照Li Yi等[6]的方法，并稍作修改。取SD大鼠乙醚麻醉后頸椎脫臼處死，75%體積分數乙醇溶液滅菌處理，在超凈臺中取出大鼠的胸主動脈，浸泡于含105U/L肝素鈉的DMEM培養液中，輕輕剝離血管外周結締組織和脂肪，使血管內膜外翻并扎緊其兩端，用2 mg/mL的I膠原酶處理1.5 h（放于37℃的細胞培養箱中），取出血管將血管兩端剪掉，其他部分剪為長、寬均為2 mm的小塊，內膜部分緊貼培養瓶底部，加入1 mL左右培養基，6 h后補加培養基，2～3 d即可觀察到內皮細胞爬出。選擇3～6 代細胞進行實驗。

1.3.2 離體血管分組及PA處理

同1.3.1節剝離大鼠胸主動脈血管。設置空白組、PA刺激組、5.381 μg/mL的TBBE保護組及1 μmol/L的DPI保護組。空白組：大鼠胸主動脈血管用含有10%血清的DMEM培養基孵育2.5 h。PA刺激組：大鼠胸主動脈血管用含有10%血清的DMEM培養基孵育0.5 h后，添加PA（100 μmol/L）再孵育2 h。TBBE保護組：大鼠胸主動脈血管用含有5.381 μg/mL TBBE的DMEM培養基（10%血清）孵育0.5 h后，添加PA（100 μmol/L）再孵育2 h。DPI保護組：大鼠胸主動脈血管用含有1 μmol/L DPI的DMEM培養基（10%血清）孵育0.5 h后，添加PA（100 μmol/L）再孵育2 h。

1.3.3 小鼠分組及飼喂

設置空白組、高脂飼喂組、高脂飼喂+TBBE（76.47 mg/kg）灌胃組、高脂飼喂+TBBE（149.3 mg/kg）灌胃組、高脂飼喂+200 mg/kg的二甲雙胍（metformin，Met）灌胃組5 組，每組各10 只小鼠，共灌胃14 d。空白組：小鼠采用正常飼料飼喂，每天灌胃質量分數0.3%的羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）。高脂飼喂組：小鼠采用高脂飼料飼喂，每天灌胃0.3%的CMC-Na。TBBE灌胃組：小鼠采用高脂飼料飼喂，每天灌胃用CMC-Na（0.3%）配制的不同劑量的TBBE（74.67 mg/kg或149.3 mg/kg）。Met灌胃組：小鼠采用高脂飼料飼喂，每天灌胃用CMC-Na（0.3%）配制的Met（200 mg/kg）。

小鼠胸主動脈血管的剝離：不同組別小鼠飼喂14 d后，頸椎脫臼處死，體積分數75%的乙醇溶液滅菌處理，迅速剖開小鼠腹腔，找到并小心取出小鼠胸主動脈血管。

1.3.4 MTT法考察提取物對細胞活性的影響

將1.3.1節中獲得的內皮細胞接種于96 孔板，待生長約60%融合度的時候，對細胞進行不同劑量TBBE孵育（24 h），按照MTT試劑盒使用說明處理細胞，以570 nm波長處空白組細胞吸光度為100%，考察TBBE對細胞活性的影響。

1.3.5 細胞ROS及NOX4檢測

將1.3.1節中獲得的內皮細胞接種于48 孔板，待生長約80%融合度的時候，對細胞進行不同劑量TBBE孵育及PA處理，使用DCFH-DA探針考察TBBE對細胞ROS產生的影響。將細胞接種于6 孔板，待生長約80%融合度的時候，對細胞進行不同劑量TBBE孵育及PA處理，提取細胞蛋白并定量，預先制備Western blot分離膠及濃縮膠，加入蛋白樣品，電泳，轉膜，對聚偏氟乙烯膜進行封閉、一抗及二抗孵育，壓片及顯影，考察提取物對NOX4蛋白活性的影響。

1.3.6 免疫組化分析大鼠離體血管及小鼠血管內膜NOX4表達

收集1.3.2節中空白組、PA孵育及TBBE、DPI處理的大鼠胸主動脈，及剝離1.3.3節中空白組、高脂飼喂及TBBE、Met灌胃處理小鼠的胸主動脈血管。

離體血管（大鼠）及在體血管（小鼠）經磷酸鹽緩沖液清洗后，分別使用4%聚甲醛固定。對血管進行脫水，石蠟包埋，切片，脫水處理，再使用二甲苯和不同濃度乙醇溶液對切片進行脫蠟處理，檸檬酸緩沖液蒸煮切片20 min使抗原暴露，滴加體積分數3% H2O2溶液消除內源性過氧化氫酶減少背景，用3% BSA在濕盒中對切片進行封閉1 h，依次對切片進行一抗（anti-NOX4）、二抗及SABC孵育，滴加DAB顯色劑，蘇木素復染，不同濃度乙醇溶液及二甲苯對切片進行脫水處理，封片。顯微鏡下觀察提取物對血管內膜NOX4表達的影響。

1.3.7 大鼠血管內皮依賴性舒張的檢測

參照Li Jia等[24]的方法，略作修改。如1.3.1節剝離及處理大鼠胸主動脈血管，放入K-H液中，制備為1 cm長的血管環，懸掛在37 ℃預熱的K-H液浴槽的兩根相同長度且平行放置的鋼絲間，通入95% O2及5% CO2，打開生物機能實驗系統收集血管張力信號，調節血管基礎張力2 g，平衡1.5 h。

先用60 mmol/L氯化鉀處理10 min使血管收縮，K-H液沖洗血管使之恢復至基礎張力，重復使血管收縮、恢復基礎張力共3 次，加入1×10－6mol/L苯腎上腺素使血管處于收縮狀態10 min，添加1×10－5mol/L乙酰膽堿，若血管舒張大于80%，可認為其內皮功能完整。選取內皮功能完整的血管環與5.381 μg/mL的TBBE或1 μmol/L的DPI共孵育30 min，繼而加入100 μmol/L PA處理30 min，K-H液沖洗使之恢復基礎張力，加入1×10－6mol/L苯腎上腺素導致血管收縮10 min，依次累積添加1×10－9、1×10－8.5、1×10－8、1×10－7.5、1×10－7、1×10－6.5、1×10－6、1×10－5.5、1×10－5mol/L乙酰膽堿舒張血管。記錄并計算空白組、PA處理組、TBBE干預或DPI干預組血管舒張率。血管舒張率根據式（1）計算。

1.3.8 小鼠血清及組織指標的檢測

兩周后，禁食8 h，稱小鼠體質量，摘眼球取血，收集并獲得血清，檢測血糖及FFAs水平，收集附睪脂肪及肝臟并稱質量，分別根據公式（2）、（3）計算附睪脂肪系數及肝臟系數。

1.4 數據處理

Western blot圖及免疫組化圖使用Image-Pro Plus 6軟件掃描光密度值。實驗所得數據表示為 ±s，進行ANOVA方差分析和t檢驗，PS軟件作圖。P＜0.05及P＜0.01均表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 苦蕎麩皮DCI對內皮細胞活性的影響

圖1 TBBE劑量對細胞存活狀態的影響Fig. 1 Effect of TBBE concentration on the viability of cells

如圖1所示，以空白組細胞相對存活率為100%，低于50 μg/mL對細胞相對存活率沒有顯著影響，100.00 μg/mL則降低細胞活性。因為0.053 81、0.538 1、5.381 μg/mL的TBBE分別相當于0.10、1.00、10.00 μmol/L的DCI，這也是大多細胞研究采用的劑量[22]；因此，本研究中采用0.053 81～5.381 μg/mL劑量TBBE進行后續的細胞實驗。

2.2 苦蕎麩皮DCI對內皮細胞氧化應激的影響

NOX4是內皮細胞中含量最多的NOX亞型[14]，NOX活性的高低顯示了細胞氧化應激的水平，其激活是導致細胞氧化應激的重要原因[25]，也是內皮功能損傷的重要誘導因素[26]。因此，進一步考察TBBE對內皮細胞氧化應激及NOX4相對活力的影響。

圖2 TBBE抑制PA引起的細胞ROS產生（A）及NOX4相對活力（B）Fig. 2 TBBE inhibited PA-induced ROS production (A) and NOX4 relative activity (B) in cells

本研究結果表明（圖2A），PA處理導致內皮細胞ROS水平顯著升高，而不同劑量TBBE干預有效降低細胞內ROS的水平（P＜0.01）。且陽性藥DPI（NOX活性抑制劑）顯著降低ROS水平。說明藥理抑制NOX活性能有效抑制細胞氧化應激，然而TBBE降低ROS的作用是否與抑制NOX活性有關，仍需進一步考察。

由圖2B可知，PA組顯著提高內皮細胞NOX4的表達（P＜0.01），而NOX4表達提高即意味著其活性升高，說明PA引起ROS產生依賴于對NOX4的激活，3 種劑量的TBBE干預組均有效抑制NOX4相對活力。雖然研究報道苦蕎具有抑制氧化應激的作用[27]，且黃酮多酚等是苦蕎食品中重要的抗氧化物質[28]，但該提取物富含DCI，僅含0.33 g/100 g的蘆丁，未檢測到槲皮素（小于0.02 g/100 g）。提示DCI可能是TBBE發揮功能的物質基礎，TBBE可通過調節NOX4相對活力抑制細胞氧化應激。

2.3 苦蕎麩皮DCI對離體血管內膜NOX4及血管舒張的影響

由于TBBE顯著抑制內皮細胞氧化應激。但在離體組織中提取物是否有相似作用，是否進而可以保護內皮功能，因而對離體血管進行免疫組化分析NOX4相對活力并考察提取物對血管舒張的影響。

圖3 TBBE抑制PA引起的大鼠離體血管內膜NOX4相對活力Fig. 3 TBBE inhibited PA-induced NOX4 relative activity in thoracic aorta of rats in vitro

由圖3可知，與空白組相比，PA刺激組離體血管內膜部分棕色顏色加深，即NOX4表達升高，而5.381 μg/mL的TBBE干預組血管內膜NOX4表達減少，DPI組顯示出與TBBE組相似的抑制NOX4相對活力的作用。說明TBBE可以在離體組織層面抑制NOX4相對活力，并可能抑制氧化應激。

圖4 TBBE促進血管的內皮依賴性舒張Fig. 4 TBBE restored the loss of endothelium-dependent relaxation of thoracic aorta

不同處理組的血管舒張率見圖4。空白組表示血管內皮功能完整，PA刺激后血管舒張率極顯著降低（P＜0.01），說明PA具有刺激損傷內皮功能。TBBE干預組血管舒張率與PA組相比有顯著提高，說明TBBE改善高脂狀態下內皮功能紊亂現象。DPI與TBBE有相似作用。

苦蕎中多種成分，如蘆丁、槲皮素、中肌醇、DCI等均可抑制氧化應激，進而保護內皮功能[22-23]。由于本研究中TBBE富含DCI，僅含有0.85 g/100 g的中肌醇及微量蘆丁物質，因此提示TBBE保護內皮的作用極有可能是DCI起到了主要作用，且TBBE通過抑制NOX4活性從而改善離體血管舒張作用，進一步闡明苦蕎預防心血管疾病的機理。

2.4 苦蕎麩皮DCI對在體小鼠血管內膜NOX4及相關指標的影響

因為細胞及離體組織均是體外研究，因此希望在體內進一步驗證TBBE對小鼠內皮功能及其他指標的影響。因而考察TBBE對HFD小鼠血管內膜NOX4及對小鼠血清葡萄糖、FFAs、附睪脂肪系數、肝臟系數及體質量的影響。

圖5 TBBE抑制HFD引起的小鼠血管內膜NOX4相對活力Fig. 5 TBBE inhibited HFD diet-induced NOX4 relative activity in thoracic aorta of mice in vivo

由圖5可知，高脂處理提高了小鼠血管內膜部分棕色顆粒的增多，即NOX4相對活力升高，灌胃74.67、149.3 mg/kg（相當于25、50 mg/kg的DCI）的TBBE有效降低了小鼠血管內膜部分NOX4的相對活力，可能進一步抑制HFD小鼠血管氧化應激現象。

表1 提取物對小鼠血清指標及組織系數的影響Table 1 Effect of TBBE on blood glucose, FFAs, and epididymal fat coefficient, liver coefficient and body mass of mice

由表1可知，HFD引起小鼠血清中FFAs濃度顯著升高，提示高脂造成過量FFAs可能與小鼠血管內皮細胞NOX4相對活力升高有關。而不同劑量TBBE能有效降低血清中FFAs的水平，該作用可能有助于TBBE在高脂狀態下抑制內皮細胞氧化應激并保護內皮功能。另外，高脂飼喂14 d并沒有引起小鼠血糖水平升高，說明此時小鼠模型處于非高血糖或糖尿病狀態。高脂飼喂以及提取物灌胃處理對小鼠附睪脂肪系數、肝臟系數及體質量均無顯著影響，說明此時小鼠沒有出現肥胖等現象。本部分研究顯示，TBBE可以逆轉非糖尿病或非肥胖狀態下高脂引起的內皮功能損傷，也進一步揭示了合理食用苦蕎具有保護內皮功能。

內皮是多種疾病的始動環節，且預防內皮功能紊亂有效延緩相關疾病的發生[4-5]。大量文獻表明，蕎麥具有治療動脈粥樣硬化[29]、減輕高血壓癥狀[30]及降低高血糖[31]等作用，但本研究提出富含DCI的苦蕎提取物具有保護高脂狀態下內皮功能的作用，該活性可能有助于苦蕎預防或治療多種以內皮功能紊亂為早期特征的疾病，如心血管疾病及糖尿病等。

3 結 論

在內皮細胞中，TBBE顯著抑制PA引起的ROS的產生及NOX4相對活力，可知苦蕎麩皮DCI提取物能降低NOX4相對活力并抑制內皮細胞氧化應激。

在離體血管組織中，TBBE有效抑制血管內膜NOX4的表達，并顯著恢復因PA造成的血管內皮依賴性舒張受損（P＜0.01），且抑制NOX4相對活力也明顯改善血管舒張功能。說明苦蕎麩皮DCI可通過抑制NOX4相對活力改善高脂狀態下血管的舒張。

高脂飼喂小鼠后，灌胃TBBE可明顯降低非糖尿病或非肥胖狀態下脂毒性引起的血管內膜NOX4激活現象。本研究從細胞、離體組織、在體動物3 個層面，揭示苦蕎能夠改善高脂狀態下內皮功能紊亂并可能因此具有預防或治療多種心血管疾病、糖尿病等的作用。