飼養方式對蘇尼特羊腸道菌群與脂肪酸代謝的影響

王柏輝，楊 蕾，羅玉龍，王 宇，袁 倩，王德寶，靳 燁*

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

隨著國家退化草地限牧、退牧還草及禁牧舍飼、恢復草地生態政策的實施，內蒙古、新疆和青海等以放牧為主的地區逐漸改變飼養模式，由傳統的天然放牧或放牧補飼的飼養方式轉變為舍飼或舍飼與放牧（季節性）相結合的飼養管理方式，這種轉變的確帶來了明顯的生態環境效應和產生了巨大的社會效益，但同時帶來了一些負面影響；其中放牧羊圈養后造成的羊肉品質劣化是消費者的一個普遍認識。放牧羊肉在風味上顯著優于舍飼羊，羊肉異味發生率明顯低，并且放牧羊肉營養素組成和功能性成分含量方面也優于非放牧羊[1-2]。蘇尼特羊作為內蒙古獨特的優良羊種，蛋白含量高、膻味輕，并且富含人體所需的各種氨基酸和脂肪酸，具有較高的營養價值[3]。

近年來，動物體內胃腸道微生物是研究熱點，大量文獻報了道腸道微生物與動物（包括人類）營養代謝、肥胖、脂肪沉積和糖尿病等的關系，胃腸道微生物在營養代謝方面的作用主要包括碳水化合物代謝、蛋白質和氨基酸代謝、脂質代謝、維生素代謝及礦物質代謝等[4-5]。研究表明動物飲食和能量代謝的不同、羊腸道菌群的變化與肉中化學組成的變化有密切的聯系[6]。也有研究表明首先脂肪沉積與擬桿菌屬和厚壁菌屬的比例有密切關系，其次細菌基因可能調控與脂代謝途徑相關基因。腸道微生物的發酵產物短鏈脂肪酸作為機體的能源物質，可調控G蛋白偶聯受體（GPCR 41和GPCR 43）的活性，其與脂肪代謝相關酶（脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶等）間具有相互協同、相互調控的作用[7-9]。另外，研究不同飼養模式下蘇尼特羊腸道微生物及代謝產物和血液與羊肉中脂肪酸的相互關系，為今后改善放牧羊圈養后羊肉品質的劣化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在內蒙古烏拉特中旗，選擇兩種飼養方式（放牧和放牧+舍飼）12 月齡蘇尼特羊共24 只，每組12 只，公母各半。放牧組：斷奶后，自由放牧12 個月；放牧+舍飼組：斷奶后，自由放牧9 個月后舍飼喂養3 個月。在放牧條件下，牧草種類以烏拉特中旗荒漠化草原典型牧草（芨芨草、蒙古蔥、中間錦雞兒、沙生冰草、堿韭等10余種）為主；舍飼條件下，草料以農區飼草料（玉米秸稈、葵盤粉、葵花籽皮等，同時補充玉米精料及育肥飼料）為主，放牧組和放牧+舍飼組體質量分別約為40.8 kg和28.55 kg。屠宰前，用乙二胺四乙酸抗凝劑的真空采血管采集羊頸靜脈血液約2 mL；屠宰后，取背最長肌60 g于－20 ℃保藏待用。收集糞便約20 g于無菌無酶凍存管中，液氮運輸，－80 ℃保藏待測。

三氯甲烷、三氟化硼-乙醚絡合物、氯化鈉、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、硫酸、乙醚（均為分析純）、正己烷（色譜純）、甲醇（色譜純）、37 種脂肪酸甲酯的混合標準品 美國Sigma公司；甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒 德國QIAGEN公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸標準品 天津光復科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質譜聯用儀 美國賽默飛世爾科技公司；RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HJ-6型多頭磁力攪拌加熱器 江蘇榮華儀器制造有限公司；5810R離心機 德國Eppendorf公司；HH-4水浴鍋 上海福瑪實驗設備有限公司；GRX-9053A型熱空氣干燥箱 上海一恒科技有限公司；FTC-3000聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 加拿大Funglyn Biotech公司。

1.3 方法

1.3.1 腸道微生物菌群的測定

1.3.1.1 糞便總DNA提取

采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取細菌總DNA，用核酸濃度測定儀測定總DNA濃度，于－20 ℃保存備用。

1.3.1.2 細菌16S rDNA序列擴增和MiSeq測序

選取16S rDNA的V4～V5區序列進行高通量測序分析。采用兩步PCR擴增方法進行文庫構建。將純化的DNA作為模板，利用16S rDNA V4～V5區通用引物515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’）和907R（5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’）擴增目的片段16S rDNA V4～V5區，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測效果較好的樣本進行2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收，以回收產物為模板進行一次8 個循環的PCR擴增，將Illumina平臺測序所需要的接頭，測序引物和標簽序列添加到目的片段兩端。全部PCR產物采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進行回收，并用PCR儀進行熒光定量，均一化混勻后完成文庫構建，在Illumina MiSeq平臺上完成測序。此實驗由上海微基生物科技有限公司完成。

1.3.2 腸道微生物代謝物的測定

1.3.2.1 短鏈脂肪酸標準曲線的繪制

分別取標準品（純度為99%）1 mL用色譜純甲醇定容至10 mL容量瓶中，依次10 倍稀釋為6 個梯度（10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6）。

1.3.2.2 短鏈脂肪酸的提取

稱取0.1～0.2 g糞便與2 mL冰生理鹽水，再加入1 mL 50%的硫酸溶液后漩渦混勻，10 000 r/min離心5 min。然后再加入2 mL乙醚充分混勻，10 000 r/min離心5 min，靜止分層，取上清液，用0.22 μm有機濾膜過濾后，用于氣相色譜分析。

1.3.2.3 氣相色譜-質譜條件

氣相色譜條件：DB-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，載氣流速1.2 mL/min，進樣口溫度250 ℃，進樣量為1 μL，分流比10∶1。采用程序升溫：初始溫度為100 ℃，保持0.5 min，然后以8 ℃/min的速率升至180 ℃，保持1 min；然后以20 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min。

質譜條件：離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，質量掃描范圍m/z 40～450。

1.3.3 血脂指標的測定

采用分光光度法，根據測定試劑盒說明書操作步驟，對TG、TC、HDL-C、LDL的濃度進行測定。

1.3.4 羊肉中脂肪酸的測定

1.3.4.1 脂肪酸的提取

根據Folch等[10]的方法進一步調整：稱取5 g已均質肉樣加入氯仿-甲醇混合液（2∶1，V/V），振搖2 h，浸泡8 h后用G3漏斗過濾，濾液中加入5 mL質量分數20%氯化鈉溶液，靜止分層，下層的氯仿層即為脂肪提取液。通過無水硫酸鈉脫水后，40 ℃旋轉蒸發濃縮得到脂肪。然后加入0.5 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液5 mL，70 ℃下回流5 min，進行脂肪皂化，隨后加入5 mL的三氟化硼乙醚溶液，70 ℃下回流2 min，進行脂肪甲酯化。最后加入2 mL色譜純正己烷，70 ℃下回流1 min后，加入5 mL飽和NaCl溶液，靜置10 min，吸取出1 mL正己烷層于進樣瓶中，用0.22 μm有機濾膜過濾后，進行氣相色譜分析。

1.3.4.2 氣相色譜-質譜分析

氣相色譜條件：反式色譜柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm），載氣為氦氣，載氣流速1 mL/min，進樣口溫度240 ℃，進樣量1 μL，分流比100∶1。采用程序升溫：初始溫度為60 ℃，保持1 min，然后以20 ℃/min的速率升至120 ℃，保持1 min；然后以5 ℃/min的速率升至240 ℃，保持15 min。

質譜條件：離子源溫度為300 ℃，傳輸線溫度240 ℃，質量掃描范圍m/z 50～500，溶劑延遲時間4 min。

1.4 數據分析

數據用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析和相關性分析（Pearson系數）。

2 結果與分析

2.1 飼養方式對腸道菌群的影響

通過應用高通量測序技術對兩組糞便樣品進行測序分析可知，門水平上，腸道菌群以厚壁菌門和擬桿菌門為主，約占94%；從屬水平上來說，測序結果中豐度大于1%的主要包括擬桿菌屬、Alistipes、纖維桿菌屬、Phocaeicola和瘤胃球菌屬。

表1 飼養方式對腸道微生物相對豐度的影響Table 1 Effects of two different feeding patterns on the abundance of intestinal flora%

由表1可知，在兩種飼養方式下，厚壁菌門和擬桿菌門的豐度沒有顯著差異（P＞0.05）。放牧+舍飼組中擬桿菌屬、Alistipes和Phocaeicola的豐度要顯著高于放牧組（P＜0.05），而纖維桿菌屬和瘤胃球菌屬的豐度顯著低于放牧組（P＜0.05）。放牧組中厚壁菌門與擬桿菌門的比值高于放牧+舍飼組，但差異不顯著（P＞0.05）。Sonia等[7]研究表明相對于瘦的動物或人，肥胖的動物或人的腸道菌群中有較高比例的厚壁菌門，較低比例的擬桿菌門，這與本研究中結果相一致。由于放牧組中擬桿菌屬的比例顯著低于放牧+舍飼組，并且放牧組的肌內脂肪含量高于放牧+舍飼組，肌內脂肪含量分別為3.33%和2.55%，從而進一步說明了腸道菌群與脂肪沉積有密切關系。

2.2 飼養方式對腸道微生物代謝物的影響

表2 飼養方式對腸道微生物代謝物含量的影響Table 2 Effects of two different feeding patterns on the contents of intestinal short chain fatty acids μg/g

由表2可知，兩種飼養方式對腸道微生物代謝物的含量有顯著影響。放牧組中乙酸、丁酸和戊酸的含量顯著低于放牧+舍飼組（P＜0.05），而丙酸和異戊酸的含量顯著高于放牧+舍飼組（P＜0.05），異丁酸含量在兩組間沒有顯著差異（P＞0.05）。

動物飲食通過小腸被吸收或消化，腸道菌群的代謝物主要是短鏈脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸為主。短鏈脂肪酸作為機體的主要能源物質，為機體的脂肪代謝、蛋白質代謝、碳水化合物代謝等提供能量[11]。腸道微生物代謝物直接影響小腸功能，也可能影響胃、腦、脂肪組織和肌肉組織。有研究表明脂肪組織是腸道微生物代謝物的富集的靶點，進而說明腸道微生物代謝與脂肪沉積有著顯著關系[7]。

2.3 飼養方式對血脂指標的影響

表3 飼養方式對血液中血脂指標的影響Table 3 Effects of two different feeding patterns on plasma lipid parameters mmol/L

由表3可知，兩種飼養方式對血液中血脂指標有顯著的影響。放牧+舍飼組血液中TC和HDL-C的濃度顯著高于放牧組（P＜0.05），而TG和LDL-C的濃度無顯著差異（P＞0.05）。

血液中TG反映了機體對脂類的利用情況，TG濃度越低，意味著機體對脂肪的利用率越高。脂類在體內運輸發生障礙時，血脂濃度會明顯升高。TC濃度對動物肌間脂肪濃度有較大的影響，TC濃度低的個體其肌間脂肪濃度高而肌間膽固醇濃度低[12]。放牧組血液中TC濃度低于放牧+舍飼組，TG濃度高于放牧+舍飼組，進一步說明放牧羊機體代謝對脂肪的利用率比較低，從而其肌內脂肪濃度較高。HDL-C濃度反映了血漿中高密度脂蛋白含量，高密度脂蛋白的主要功能是將肝外組織中過多的膽

固醇轉運到肝臟代謝，以防止膽固醇在這些組織中過多地聚集。放牧羊血液中HDL-C的濃度低于放牧+舍飼羊，且脂肪細胞中膽固醇大部分由循環血液中攝取而來，可推測放牧羊肌肉組織和脂肪組織中膽固醇濃度較少。并且也有研究表明HDL-C與機體質量有密切關系[13]。

2.4 飼養方式對肌肉中脂肪酸的影響

表4 飼養方式對蘇尼特羊肉中脂肪酸含量的影響Table 4 Effects of two different feeding patterns on fatty acid contents in meat from Sunit sheep%

由表4可知，在兩種飼養方式下蘇尼特羊背最長肌中脂肪酸主要以棕櫚酸、硬脂酸和油酸為主，約占78%，其所占比例依次為油酸＞棕櫚酸＞硬脂酸，這與Atti[14]和Cividini[15]等的研究結果一致。兩種飼養方式下，飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFA）和單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）含量平均值分別為44.4%和41.9%。放牧組中多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）的含量顯著高于放牧+舍飼組（P＜0.05），約高2.24%。

兩種飼養方式下，蘇尼特羊背最長肌中SFA主要以棕櫚酸和硬脂酸為主，兩者分別約占總脂肪酸的22.6%和19.5%，差異不顯著（P＞0.05）。放牧組中癸酸的含量顯著低于放牧+舍飼組（P＜0.05），而月桂酸的含量顯著高于放牧+舍飼組（P＜0.05）。兩種飼養方式對肉豆蔻酸含量無顯著影響。

蘇尼特羊背最長肌中MUFA主要包括棕櫚油酸、油酸和反式油酸。由表4可知，兩種飼養方式對油酸和棕櫚油酸的含量沒有顯著影響（P＞0.05）。放牧組反式油酸的含量顯著高于放牧+舍飼組（P＜0.05），這與Wachira[16]和Vasta[17]等的研究結果相一致，這可能與牧草中PUFA含量較高有關系。

由表4可知，兩種飼養方式對長鏈脂肪酸的含量有顯著影響。放牧組中α-亞麻酸的含量要顯著高于放牧+舍飼組（P＜0.05）。亞麻酸是長鏈脂肪酸合成的前體物質，并且具有較為廣泛的生物學意義且對人體健康有益[18-19]。有研究表明放牧轉變為舍飼后時間長短對亞麻酸含量的影響有顯著影響，轉變后時間較短組羊肉中亞麻酸的含量要顯著高于轉變后時間較長組[20]。放牧組中二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）（C20:5）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）（C22:6）所占總脂肪酸的比例顯著高于放牧+舍飼組（P＜0.05），分別為1.05%和0.75%、1.27%和0.93%。EPA和DHA是兩種功能性長鏈脂肪酸，具有抗氧化、抗衰老作用，可用于健腦補腦，提高記憶力及思維能力，對記憶力減退、老年性癡呆有一定療效[21]。兩種飼養方式對亞油酸和反式亞油酸的含量沒有顯著影響（P＞0.05），其同分異構體主要包括共軛亞油酸。研究表明共軛亞油酸具有抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等重要的生理功能。放牧組中共軛亞油酸的含量顯著大于放牧+舍飼組，其原因可能是牧草有利于肌內脂肪中共軛亞油酸的沉積，這與Urrutia等[22]的研究結果一致，表明高含量脂肪物質（亞麻酸和亞油酸）能極顯著促進共軛亞油酸在組織中沉積。

放牧組中背最長肌n-3 PUFA的比例顯著高于放牧+舍飼組（P＜0.05），分別為4.24%和2.63%。兩種飼養模式下羊肉的n-6/n-3比例依次分別為2.14和3.87，差異顯著（P＜0.05）。兩種飼養模式的比值都低與歐美等國家推薦的4∶1。營養專家認為合理的n-6/n-3比例有利于降低血壓、抑制不規律心臟跳動、維持能量平衡、糖代謝和其他慢性疾病的發生，以及促進正常的生長發育，如何改善飼養模式下羊肉的n-6/n-3比例還需進一步的研究[23]。

2.5 腸道菌群及代謝產物與血脂指標間相關性分析

表5 腸道微生物與其代謝物和血脂指標相關性分析Table 5 Correlation coefficients between the abundance of intestinal flora, fecal short chain fatty acids and plasma lipid parameters

由表5可知，通過分析腸道微生物與短鏈脂肪酸濃度的相關性可知，丙酸濃度與Alistipes豐度（P＜0.05）、纖維桿菌屬豐度（P＜0.01）和瘤胃球菌屬豐度（P＜0.01）間存在顯著正相關；與擬桿菌屬豐度（P＜0.01）和Phocaeicola豐度（P＜0.05）存在顯著負相關。可溶性膳食纖維在結腸微生物的作用下可產生短鏈脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。丙酸在碳水化合物和蛋白質代謝過程中扮演著重要的角色，并且有利于維持結腸的正常功能和腸上皮細胞的形態和功能具有重要作用[24]。在本研究中，放牧組中丙酸的含量顯著高于放牧+舍飼組，可推測出牧草的多樣性有利于丙酸在體內的沉積，也可能有利于羊肉風味物質的形成。本實驗還發現Phocaeicola豐度與異丁酸和異戊酸含量呈顯著正相關（P＜0.05）。

通過分析血液中血脂指標與腸道微生物的關系可知，TC濃度與擬桿菌屬豐度之間存在顯著正相關（P＜0.05），與瘤胃球菌屬豐度之間存在顯著負相關（P＜0.05）。哺乳動物細胞中膽固醇的合成是一個復雜的過程，其以乙酰輔酶A為原料，經過40余個細胞溶質和膜結合酶的催化作用完成。有研究表明腸道中丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）細菌的濃度與動脈粥樣硬化患者血漿中TC和LDL-C的濃度呈正相關，并通過口服益生菌有利于改善腸道微生物，從而降低血液中TC濃度。其可能存在的潛在機理是由于NPC1L1蛋白是介導哺乳動物小腸對膳食中膽固醇吸收的關鍵蛋白質，益生菌通過抑制腸道內NPC1L1蛋白的表達，來降低血液中TC和LDL-C的濃度[25-26]。

2.6 長鏈脂肪酸與腸道菌群及代謝物和血液指標間相關性分析

表6 長鏈脂肪酸與腸道微生物及其代謝物和血脂指標相關性分析Table 6 Correlation coefficients between long chain fatty acids of muscle and the abundance of intestinal flora and plasma lipid parameters

如表6所示，通過分析羊肉中長鏈脂肪酸和腸道菌群間相關性可知，羊肉中共軛亞油酸與含量纖維桿菌屬豐度（P＜0.05）、瘤胃球菌屬豐度（P＜0.001）和Alistipes豐度（P＜0.05）間存在顯著正相關，與擬桿菌屬豐度存在顯著負相關（P＜0.01）。有研究認為機體內共軛亞油酸主要通過瘤胃微生物丁弧酸菌對亞油酸的生物轉換作用生成，也可能是腸道微生物在動物細胞內起脫氫作用產生[27-28]。反式油酸含量與擬桿菌屬豐度間存在顯著負相關，而與Alistipes豐度存在顯著正相關。其原因可能是由于哺乳動物體內無Δ-12-脫氫酶，反式油酸進入機體后，通過瘤胃和腸道微生物異構化作用由油酸生成共軛亞油酸[29]。眾所周知，α-亞麻酸是人體必需脂肪酸，是n-3系列PUFA的母體，也是反芻動物瘤胃中脂肪酸代謝主要的氫化底物[30]。羊肉中亞麻酸的含量與纖維桿菌屬、瘤胃球菌屬和Alistipes豐度間存在極顯著正相關（P＜0.01），與擬桿菌屬豐度間存在顯著負相關（P＜0.05）。纖維桿菌屬豐度與EPA和DPA含量間存在極顯著正相關（P＜0.01）。通過分析羊肉中長鏈脂肪酸與腸道微生物代謝物與血液中血脂指標濃度的相互關系可知，亞麻酸含量與乙酸含量、異丁酸含量和異戊酸含量間存在顯著負相關（P＜0.05），而與丙酸含量呈極顯著正相關（P＜0.01），還發現EPA和DHA含量與丙酸含量呈現顯著正相關（P＜0.05）。飲食與腸道微生物代謝物間有密切聯系，富含亞麻酸的飲食對動物腸道菌群多樣性有顯著影響，進而能夠促進動物組織中亞麻酸的沉積。血液中TC濃度與肌肉中亞麻酸和共軛亞油酸含量間呈現顯著負相關（P＜0.05），從而說明高含量亞麻酸和共軛亞油酸的飲食有利于降低血液中TC的濃度，對預防粥樣動脈硬化等疾病有重要意義。綜上所述，亞麻酸代謝與腸道菌群及其代謝物和血液脂質代謝有密切的聯系，如何改善腸道菌群的多樣性，進而影響機體內亞麻酸代謝，從而為改善哺乳動物肉和乳中長鏈脂肪酸的沉積，也是未來課題研究的新方向。

3 結 論

放牧組蘇尼特羊中纖維桿菌屬和瘤胃球菌屬的豐度顯著高于放牧+舍飼組，而擬桿菌屬、Alistipes和Phocaeicola的豐度顯著低于放牧+舍飼組。放牧+舍飼組中乙酸和丁酸的含量顯著高于放牧組，而丙酸的含量顯著低于放牧組。放牧組中TC和HDL-C濃度要低于放牧+舍飼組，TG和LDL-C的含量無顯著影響。兩種飼養方式下，脂肪酸主要以棕櫚酸，硬脂酸和油酸為主。放牧組中α-亞麻酸、EPA、DHA和共軛亞油酸的含量顯著高于放牧+舍飼組，n-3系列的PUFA含量也顯著高于放牧+舍飼組。放牧條件下菌群結構更有利于短鏈脂肪酸的產生，進而有利于PUFA沉積，提高了羊肉營養價值。

丙酸含量與Alistipes、纖維桿菌屬和瘤胃球菌屬豐度存在顯著正相關，與擬桿菌屬和Phocaeicola豐度存在顯著負相關。膽固醇濃度與擬桿菌屬豐度存在顯著正相關，與瘤胃球菌屬豐度存在顯著負相關。蘇尼特羊肉中共軛亞油酸和α-亞麻酸含量與腸道微生物豐度存在顯著的相關性，與血液中TC濃度存在顯著負相關，并且丙酸含量與EPA和DHA含量存在顯著正相關。因此，如何改善腸道菌群的多樣性，建立腸道菌群與機體亞麻酸代謝的關系，有利于羊肉中長鏈脂肪酸的沉積，為改善舍飼羊肉風味和營養物質提供一種新的思路。