基于肝門靜脈注射腫瘤細胞的新型進展期肝臟腫瘤動物模型的建立

柴燕濤，姜棋予，馮 帆，孫慧偉，李曉娟，楊銳創，王志杰，李瑞生，侯 俊

(解放軍第三〇二醫院臨床研究管理中心，北京 100039)

肝臟腫瘤(liver cancer)主要分為原發性肝臟腫瘤和轉移性肝臟腫瘤[1-2]，其中原發性肝臟腫瘤主要是來源于肝細胞的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[3-4]；而轉移性肝臟腫瘤則是其他臟器來源的腫瘤細胞經由膽道、血道或淋巴道遷移至肝臟內部行成的腫瘤組織，具體包括肝內膽管細胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，IHC)[5]、結直腸癌肝轉移(colorectal cancer liver metastases)[6]、肺癌肝轉移(liver metastases of lung cancer)[7]以及乳腺癌肝轉移(breast cancer liver metastases)[8]等。由于目前臨床診療技術的限制，大多數肝臟腫瘤患者初診即為進展期，其主要特征是腫瘤多發或彌散的腫瘤病灶[9 -10]。現有的肝臟腫瘤抗腫瘤藥物的研究模型主要是裸鼠皮下成瘤(subcutaneous tumor)，但存在不足之處，難以直觀反映與模擬進展期肝臟腫瘤的特性[11-12]。因此迫切需要新的和有效的動物模型以更好地模擬與反映出進展期肝臟腫瘤的特點。本研究通過肝門靜脈注射人肝細胞癌MHCC97-H、人結直腸癌SW480、人非小細胞肺癌A549以及人三陰性乳腺癌MDA-MB-231等細胞，在免疫缺陷小鼠肝臟原位形成了多發與彌散腫瘤病灶，成功獲得了進展期肝細胞癌、結直腸癌肝轉移、乳腺癌肝轉移以及非小細胞肺癌肝轉移的動物模型，為進展期肝臟腫瘤抗腫瘤藥物研究奠定了堅實基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系

MHCC97-H(高侵襲性的人HCC細胞系)[13-14]、SW480(結直腸癌細胞系)[15]、A549(非小細胞肺癌細胞系)[16]以及MDA-MB-231(高侵襲性三陰性乳腺癌細胞)[17]等為本實驗室保存。

1.1.2 實驗動物

選取SPF級BALB/c裸小鼠25只，雌性，4～5周齡，體重18～20 g(誤差不得大于10%)，購于北京斯貝福生物技術有限公司[SCXK (京) 2016-0002]。其中16只用于MHCC97-H細胞接種實驗：分為四個不同濃度組：A：5 × 105個細胞/只、B：1 × 105個細胞/只、C：5 × 104個細胞/只以及D：1 × 104個細胞/只，每組4只，每只動物注射細胞懸液的體積為500～600 μL；其余9只分為三組，用于MDA-MB0231、SW480和A549細胞接種實驗，濃度選擇5 × 105個細胞/只，每組3只，每只動物注射細胞懸液的體積為500～600 μL。飼養及無菌手術在解放軍第三〇二醫院臨床研究管理中心實驗動物中心屏障動物實驗設施中進行[SYXK (軍) 2017-0010]。飼養室溫度22℃～23℃，環境濕度50%，自由進食和飲水，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。本實驗通過醫院倫理委員會審查(項目倫理審查批準號：IACUC-2017-005)。

1.2 主要試劑與儀器

細胞實驗的DMEM培養基、胎牛血清以及胰蛋白酶等購買自美國Hyclone公司；異氟烷(isoflurane)購買自深圳瑞沃德公司；小動物PET/CT實驗使用的核素探針18F-FDG等為北京大學腫瘤醫院核醫學科提供。細胞培養瓶為美國Corning公司產品；細胞培養用恒溫培養箱、相差倒置顯微鏡等由本實驗室提供；全套解剖用手術器械由本實驗室保存；吸入式小動物麻醉劑機、蓋革計數器和PET/CT系統由北京大學腫瘤醫院科醫學科提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養實驗

MHCC97-H、SW480、MDA-MB-231以及A549等細胞使用添加10% FBS的DMEM，37℃，5% CO2條件培養。待細胞狀態良好，使用胰蛋白酶消化細胞后，對細胞懸液進行計數，備用。

1.3.2 門靜脈注射腫瘤細胞實驗

BALB/c裸小鼠使用異氟烷吸入麻醉。在超凈臺中進行實驗，小動物手術，術式為開放性手術。小鼠胸骨下緣正中處，開一個1.5 cm的開口。將肝葉輕輕擠出，剝離得到肝門靜脈，使用注射器將不同數量的不同細胞經由肝門靜脈注射入小鼠肝臟中，在這一過程中，將細胞重懸于較大體積(500～600 μL)的生理鹽水中，緩慢推注入肝門靜脈。手術過程中，主要進行鈍性分離以嚴格避免小鼠出血；嚴密觀察小鼠心率等生理狀況。

1.3.3 小動物PET/CT檢測

BALB/c裸小鼠經由尾靜脈注射約200 μCi核素探針18F-FDG，30～40 min后對BALB/c裸小鼠進行PET/CT檢測，按照18F-FDG核素掃描模式，進行12 min掃描采像[18-19]。在此基礎上，收集動物獲得肝臟組織，利用蓋革計數器確定動物肝臟于血液的核素強度，同時收集動物肝臟組織拍照。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 肝細胞癌在裸鼠肝臟形成多發與彌散的病灶

結果顯示：將不同濃度(A：5 × 105個細胞、B：1 × 105個細胞、C：5 × 104個細胞以及D：1 × 104個細胞)人肝細胞癌細胞系MHCC97-H經由肝門靜脈注射接種入裸鼠肝臟，經過4～6周生長后，使用PET/CT進行活體成像能夠檢測小鼠肝臟部位有明確的核素信號。核素強度、信號與細胞接種量有量效關系(見圖1)。在此基礎上，對動物進行解剖，剝離肝臟可見其表面已形成明確的多發、彌散腫瘤病灶，病灶形成的數量或肝臟病變的程度與肝臟接種MHCC97-H細胞的數量具有量效關系(見圖2)。這表明，經由肝門靜脈接種MHCC97-H細胞能夠在裸鼠肝臟形成多發與彌散的腫瘤病灶；腫瘤細胞在肝臟的生長過程中，可以使用PET/CT活體成像進行追蹤與判別。

注：A～D：分別為經門靜脈注入肝臟不同濃度MHCC97-H細胞后檢測到明確的核素信號(A：5 × 105個細胞，B：1 × 105個細胞，C：5 × 104個細胞，D：1 × 104個細胞)，白色箭頭所示為動物肝臟部位的核素信號與病變情況；E：蓋革計數器對核素信號進行定量展示。圖1 裸鼠肝臟接種MHCC97-H細胞后PET/CT檢測Note. A-D: Clear nuclide signals detected after injecting different concentrations of MHCC97-H cells into the liver via the portal vein (A: 5 × 105 cells; B: 1 × 105 cells; C: 5 × 104 cells; D: 1 × 104 cells). White arrow indicates the PET intensity of mouse liver. E: Quantitative display of the nuclide signal from a Geiger counter.Figure 1 Identification of intrahepatic growth of MHCC97-H cells via PET/CT screening in nude mouse liver

注：第一排：5 × 105個細胞；第二排：1 × 105個細胞；第三排：5 × 104個細胞；第四排：1 × 104個細胞。白色箭頭指示動物肝臟部位多發與彌散的腫瘤病灶。圖2 MHCC97-H細胞在裸鼠肝臟形成多發與彌散的腫瘤病灶Note. The first row: 5 × 105 cells; the second row: 1 × 105 cells; the third row: 5 × 104 cells; the fourth row: 1 × 104 cells. White arrow indicates multiple and diffuse nodules in nude mouse liver formed by the intrahepatic growth of MHCC97-H cells.Figure 2 Multiple and diffuse nodules in nude mouse liver formed by the intrahepatic growth of MHCC97-H cells

2.2 MDA-MB-231、A549以及SW480以及細胞癌在裸鼠肝臟形成多發與彌散的病灶

結果顯示：在裸鼠肝臟中經由肝門靜脈注射5 × 105個高侵襲性的乳腺癌MDA-MB-231細胞、非小細胞肺癌A549細胞或轉移性結直腸癌SW480細胞系，經4～6周生長后進行PET/CT檢測，能夠發現小鼠肝臟部位有明確的核素信號(見圖3)。在此基礎上，對動物進行解剖，剝取肝臟可見其表面有明確的多發、彌散腫瘤病灶(見圖4)。這表明，經由肝門靜脈接種A549、MDA-MB-231以及SW480細胞，細胞能夠在裸鼠肝臟形成多發與彌散的腫瘤病灶；腫瘤細胞在肝臟的生長過程中，可以使用PET/CT活體成像進行追蹤與判別。

注：A：從左向右分別為經門靜脈注入肝臟MDA-MB-231、A549、SW480細胞后檢測到明確的核素信號(5 × 105個細胞)，白色箭頭指示動物肝臟部位的核素信號與病變情況；B：蓋革計數器對核素信號進行定量展示。圖3 裸鼠肝臟接種MDA-MB-231、A549以及SW480細胞后PET/CT檢測Note. A: From left to right, the clear nuclide signals detected after injecting MDA-MB-231, A549, and SW480 cells into the liver through the portal vein (5 × 105 cells). White arrow indicates the PET intensity of mouse liver. B: Quantitative display of the nuclide signal from a Geiger counter.Figure 3 Identification of intrahepatic growth of MDA-MB-231, A549, or SW480 cells via PET/CT screening in nude mouse liver

注：第一排：MDA-MB-231細胞；第二排：A549細胞；第三排：SW480細胞。白色箭頭指示動物肝臟部位多發與彌散的腫瘤病灶。圖4 MDA-MB-231、A549以及SW480細胞在裸鼠肝臟形成多發與彌散的腫瘤病灶Note. The first row: MDA-MB-231 cells; the second row: A549 cells; the third row: SW480 cells. White arrow indicates the multiple diffuse nodules in nude mouse liver formed by the intrahepatic growth of MDA-MB-231, A549, or SW480 cells.Figure 4 Multiple diffuse nodules in nude mouse liver formed by the intrahepatic growth of MDA-MB-231, A549, or SW480 cells

3 討論

目前，受限于臨床診療技術，大多數肝臟腫瘤患者初診即為進展期，失去外科手術或肝移植等根治性治療的機會[20]。進展期肝臟腫瘤的主要特征是腫瘤細胞形成多發或彌散的腫瘤病灶，并可能伴隨有血管侵犯等[9-10]。藥物治療在進展期肝臟腫瘤綜合治療中具有重要意義，但現有的肝臟腫瘤抗腫瘤藥物的研究模型不足，難以直觀反映與模擬進展期肝臟腫瘤的特性。這體現在：①裸鼠皮下成瘤實驗雖然是體內實驗模型，但其與肝臟原位的腫瘤病灶有較大差別；②在肝臟接種組織微塊或定點注射腫瘤細胞僅能夠形成單一病灶，難以形成多發和彌散的腫瘤病灶；③現有常用的腫瘤轉移或侵襲模型，主要是通過尾靜脈注射腫瘤細胞懸液，以此在裸鼠中接種腫瘤細胞，但此時細胞迅速經由尾靜脈-下腔靜脈回心，進而通過肺動脈主要分布于肺部。為解決這些問題，本研究利用肝門靜脈注射的方法，將腫瘤細胞經由肝門靜脈接種于裸鼠肝臟，最終在肝臟形成多發與彌散的腫瘤病灶。這不僅實現了利用高侵襲性的MHCC97-H細胞形成多發與彌散的腫瘤病灶以模擬進展期肝細胞癌，也通過SW480、A549與MDA-MB-231細胞實現了結直腸癌、非小細胞肺癌與乳腺癌肝轉移。

尾靜脈注射腫瘤細胞后，細胞經由下腔靜脈回心進而留駐于肺臟的組織間隙。與之類似的，經由肝門靜脈將腫瘤細胞注射進入肝臟，腫瘤細胞也能夠留駐在肝臟組織間隙。受到毛細血管分布、血流等因素的影響，加之小鼠肝臟較薄，腫瘤細胞主要是在小鼠肝臟的表面或淺表部位形成多發與彌散的腫瘤組織。此外，肝臟血流充沛，有肝門靜脈與肝動脈雙重供血，與肺臟相比腫瘤細胞不易形成肝臟組織局部栓塞，因此尤其適合于腫瘤細胞的生長與形成病灶。在手術中，本課題組對全套手術器械進行高壓滅菌，全程在超凈工作臺中進行手術操作，能夠有效避免感染；同時在消化細胞時(收集與獲得培養的腫瘤細胞)盡可能充分消化細胞以避免細胞團塊的存在帶來栓塞的風險；利用較大體積的生理鹽水重懸細胞后，緩慢推注進入肝門靜脈，同時不斷觀察小鼠心率變化；在手術后，將小鼠分籠飼養以避免縫合后的創口的抓傷或撕咬。這些措施可使得動物存活率與造模成功率維持在較高水平。

小動物PET是前沿與先進的活體成像、分子影像技術，能夠通過檢測腫瘤組織、細胞對18F核素取代葡萄糖分子探針(18F-FDG)的攝取，對裸鼠肝臟腫瘤組織進行活體成像[21]。惡性腫瘤細胞具有旺盛的增殖能力，其對葡萄糖的攝取遠強于正常組織或器官。在此基礎上，肝臟是人體物質與能量代謝的中心器官，來源于肝細胞的肝細胞癌具有比其他惡性腫瘤或正常組織器官更為強烈的對葡萄糖的攝取作用，這使得采用PET掃描能夠特異性與有效地識別和確證腫瘤組織。在實驗中，本課題組在肝門靜脈注射腫瘤細胞后能夠利用小動物PET實現對裸鼠的活體成像，對細胞在肝臟中的生長進行無創與活體檢測。裸鼠經過PET活體成像后收集動物肝臟發現，MHCC97-H細胞能夠在裸鼠肝臟形成多發與彌散的的病灶(nodules)，為利用動物模型模擬進展期肝細胞癌以及相關抗腫瘤、抗腫瘤藥物研究奠定了堅實基礎。

除MHCC97-H細胞外，本課題組還通過肝門靜脈注射人三陰性乳腺癌MDA-MB-231、人非小細胞肺癌A549以及人結直腸癌SW480細胞，也在免疫缺陷小鼠肝臟原位形成了多發與彌散腫瘤病灶。肝臟是惡性腫瘤細胞轉移與侵襲的重要器官，包括乳腺癌、結直腸癌以及肺癌等都能夠肝轉移[22-24]。在研究中，A549是非小細胞肺癌中腺癌亞型的細胞系，代表了肺癌最為主要的病理類型；SW480細胞是一種結直腸癌轉移病灶來源的細胞系，是研究結直腸癌轉移的理想模型；MDA-MB-231細胞是三陰性乳腺癌細胞系，具有強烈的轉移與侵襲能力。MDA-MB-231、A549以及SW480細胞都能夠在裸鼠肝臟形成多發與彌散的腫瘤病灶。在實驗中對上述動物模型進行活體成像，接種MDA-MB-231、A549以及SW480細胞的裸鼠，其肝臟部位能夠為18F-FDG核素探針所識別。這表明，本研究不僅建立了結直腸癌、乳腺癌與非小細胞肺癌的肝轉移動物模型，也能夠利用小動物PET等分子影像技術進行活體成像，動態跟蹤腫瘤細胞在裸鼠肝臟的生長。