3種臨床消毒劑殺菌效果和皮膚刺激性的比較研究

武昌俊 蔡 標 童 琳 李 舜 戴陳偉 王 超 周秀紅

目前，醫院常見的致病菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌以及銅綠假單胞菌等。金黃色葡萄球菌屬革蘭氏陽性菌，能引起組織器官膿腫和手術創傷化膿[1]。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，能導致急性胃腸炎和腹瀉癥狀的發生[2]。白色念珠菌屬真菌類，通過感染人體和在人體內增殖，形成侵襲性真菌感染，導致患者嚴重感染甚至死亡[3]。銅綠假單胞菌屬革蘭陰性菌，是一種條件致病菌，能引起皮膚、軟組織和呼吸道感染，以及菌血癥等疾病[4]。而醫院消毒滅菌工作是提高醫療護理質量的前提和保障，是預防院內感染的重要手段之一[5]。目前，消毒劑已被廣泛應用于醫院的常規消毒滅菌工作中[6]。消毒劑是指能夠殺滅或抑制傳播媒介中的病原微生物的制劑，能夠切斷傳染病的傳播途徑，達到控制傳染病的目的[7]。目前，醫院醫用消毒劑有多種，但作用原理和殺菌效果大不相同。隨著消毒劑的頻繁使用，抗藥菌株不斷出現，需要定期評價不同消毒劑的消毒效果。本研究比較臨床上常用3種消毒劑的殺菌效果和皮膚刺激性，并進行相關實驗研究，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗用消毒劑 含乙醇75.4 %的無色透明液體，pH值為6.5；含有效碘0.51 %的棕色液體，pH值為2.8；含三氯生0.18 %的無色透明液體，pH值為7.4。

1.1.2 實驗菌株 大腸桿菌(ATCC 8099)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、白色念珠菌(ATCC 10231)、銅綠假單胞菌(ATCC 15442)購自安徽艾浮地艾空氣凈化檢測站，來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 實驗動物 多次皮膚刺激實驗選用健康豚鼠18只，體質量為250～300 g，隨機分為3組，每種消毒劑選用1組進行實驗。動物來源：南京安立默科技有限公司，動物合格證號：NO.0032009。動物飼養環境為室溫18～28 ℃，相對濕度為40 %～70 %。

1.1.4 培養基 營養瓊脂培養基(用于培養金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌)、沙氏培養基(用于培養白色念珠菌)，均購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.5 中和劑 細菌殺滅實驗選用中和劑為1 %(W/V)卵磷脂+1 %(W/V)吐溫80的0.03 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(乙醇)；含1 %(W/V)硫代硫酸鈉+1 %(W/V)卵磷脂+1 %(W/V)吐溫80的0.03 mol/L PBS溶液(碘伏)；含0.3 %(W/V)硫代硫酸鈉+2 %(W/V)吐溫80+0.5 %(W/V)卵磷脂的0.03 mol/L PBS溶液(三氯生)。有機干擾物為30 g/L牛血清白蛋白。

1.2 供試菌株的活化 接種供試菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和銅綠假單胞菌至相應的瓊脂試管斜面培養基上，置生化培養箱中37 ℃需氧培養24 h。每個菌種各取2支斜面供實驗用，其余冷藏備用。

1.3 菌懸液的制備 分別挑取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和銅綠假單胞菌斜面菌落接種至相應的瓊脂平板，置生化培養箱中37 ℃需氧培養24 h至對數生長期，無菌生理鹽水洗脫菌落，分別制成菌液濃度為107～108cfu/mL的菌懸液，備用。

1.4 中和劑鑒定實驗 實驗選擇金黃色葡萄球菌(細菌)和白色念珠菌(真菌)進行中和劑鑒定實驗[8]。實驗分為6組：第1組為消毒劑+菌懸液，第2組為(消毒劑+菌懸液)+中和劑，第3組為中和劑+菌懸液，第4組為(消毒劑+中和劑)+菌懸液，第5組為稀釋液+菌懸液，第6組為稀釋液+培養基+中和劑。具體實驗步驟按《消毒技術規范》衛生部2002版中懸液定量殺菌實驗程序[8]進行。第6組平板菌落數應為0；第1組平板菌落數應為0，或僅有極少；第2組平板菌落數應比第1組多，但應比第3、4、5組少；第3、4、5組組間菌落數誤差率應≤15 %，組間菌落數誤差率按下式計算。重復實驗3次，均符合要求時，判定所選中和劑及其濃度為受試樣品殺菌實驗適宜的中和劑。

1.5 懸液定量殺菌實驗 在無菌試管內分別加入0.5 mL菌懸液和0.5 mL有機干擾物溶液，再加入受試消毒劑殺菌工作濃度1.25倍的消毒劑(陽性對照為胰蛋白胨生理鹽水溶液)，快速混勻。分別作用至設定時間，取混合液0.5 mL加至裝有4.5 mL中和劑溶液的試管內，混勻作用10 min，中和殺菌反應。選取稀釋液+中和劑+培養基作為陰性對照，37 ℃培養48 h，實驗于19～21 ℃水浴條件下進行，重復上述所有實驗步驟3次。觀察實驗結果，稀釋涂平板并計算各組的菌濃度(cfu/mL)，換算成對數值，殺滅對數值[8]按下式計算：平均殺滅對數值=陽性對照組平均菌濃度對數值-實驗組平均菌濃度對數值。

1.6 多次皮膚刺激實驗 取皮膚正常完好的健康白色豚鼠6只，實驗前24 h背脊部兩側各約3 cm×3 cm備皮。將受試消毒液原液均勻涂在一側脫毛皮區，無刺激性塑料膜覆蓋表面，無刺激性膠布和繃帶加以固定，另一側脫毛皮區無處理，作為陰性對照。4 h后溫水洗凈殘留消毒劑。每天實驗處理1次，連續實驗14 d。在每次實驗后24 h觀察皮膚刺激反應并進行評分。評分方法與刺激指數計算方法參照《消毒技術規范》[8]，見表1、2。

表1 皮膚刺激反應的評分標準

表2 皮膚刺激強度分級表

按下列公式計算每天每只動物平均積分(刺激指數)，并以表2判定皮膚刺激強度。每天每只動物平均積分為每只動物14 d的紅斑和水腫總積分/(受試動物數×天數)。

2 結果

2.1 中和劑鑒定實驗結果 細菌繁殖體以金黃色葡萄球菌作為實驗菌。第1、6組平板菌落數為0；第2組平板菌落數比第1組多，但比第3、4、5組少；第3、4、5組組間菌落數誤差率分別為6.40 %、4.00 %、5.23 %，乙醇第3、4、5實驗組間菌落數誤差率差異無統計學意義(P=1.000)、碘伏第3、4、5實驗組間菌落數誤差率差異無統計學意義(P=1.000)、三氯生第3、4、5實驗組間菌落數誤差率差異無統計學意義(P=1.000)。見表3。

表3 3種消毒劑中和劑鑒定實驗(以金黃色葡萄球菌作為實驗菌)生長菌落數結果

真菌以白色念珠菌作為實驗菌。第1、6組平板菌落數為0；第2組平板菌落數比第1組多，但比第3、4、5組少；第3、4、5組組間菌落數誤差率分別為12.90 %、8.61 %、8.31 %，乙醇第3、4、5實驗組間菌落數誤差率差異無統計學意義(P=1.000)、碘伏第3、4、5實驗組間菌落數誤差率差異無統計學意義(P=1.000)、三氯生第3、4、5實驗組間菌落數誤差率差異無統計學意義(P=1.000)。見表4。

表4 3種消毒劑中和劑鑒定實驗(以白色念珠菌作為實驗菌)生長菌落數結果

2.2 3種消毒劑懸液定量殺滅實驗結果 作用0.5、1 min時，三氯生對金黃色葡萄球菌殺滅效果最佳，作用1.5 min時，乙醇殺滅效果最佳；同一時間點3種消毒劑效果差異有統計學意義(P<0.05)。作用0.5、1 min時，三氯生對大腸桿菌殺滅效果最佳，且3種消毒劑殺滅效果差異有統計學意義(P<0.05)；作用1.5 min時，乙醇殺滅效果最佳，但3種消毒劑殺滅效果差異無統計學意義(P>0.05)。作用0.5、1、1.5 min乙醇對銅綠假單胞菌、白色念珠菌殺滅效果最佳，且3種消毒劑殺滅效果差異有統計學意義(P<0.05)。3種消毒劑中，三氯生對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺滅效果最好；乙醇對銅綠假單胞菌和白色念珠菌殺滅效果最好。見表5。

表5 3種消毒劑懸液定量殺菌實驗平均殺滅對數值結果

2.3 多次皮膚刺激實驗結果 3種消毒劑原液連續對豚鼠完整皮膚涂抹14 d后，未見皮膚紅斑、水腫等異常反應，其皮膚刺激性指數為0，對豚鼠皮膚為無刺激性。

3 討論

乙醇是醫院最常用的一類消毒劑，醫用乙醇為無色澄清溶液，75 %的乙醇溶液殺菌性能最強，但有較大刺激性氣味，少數人如老人、兒童可能會產生不耐受性和過敏反應。有研究[9]表明乙醇濃度受溫度的影響較大，冬夏季溫差較大，配制醫用乙醇時一般不宜選用。碘伏是目前我國醫院消毒和家庭常用的一類皮膚用消毒劑。碘伏又名聚維酮碘，是有效碘與一類表面活性劑聚維酮相結合而形成的一種絡合物[10]。碘伏毒性低，具有廣譜的抗菌殺菌作用，對皮膚黏膜無刺激。有研究[11]表明使用碘伏對志愿者前臂內側中段皮膚表面擦拭消毒后，對皮膚表面自然菌殺滅效果符合我國消毒規范要求。三氯生學名為二氯苯氧氯酚，分子式C2H7Cl3O2，被廣泛應用于衛生香皂、消毒洗手液、傷口消毒噴霧劑等消毒領域[12]。

本研究結果顯示，作用1.5 min時，乙醇對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺滅效果最佳；作用0.5、1及1.5 min時，乙醇對銅綠假單胞菌、白色念珠菌殺滅效果最佳，且3種消毒劑殺滅效果差異有統計學意義(P<0.05)。表明乙醇對革蘭氏陽性菌、陰性菌和真菌殺滅效果較好，對細菌繁殖體和真菌具有良好的殺滅性能，殺菌譜較寬。作用0.5、1 min時，三氯生對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺滅效果最佳，且同一時間點3種消毒劑殺滅效果差異有統計學意義(P<0.05)，但對銅綠假單胞菌和白色念珠菌殺滅效果相對較差，表明三氯生對革蘭氏陽性菌和部分陰性菌滅效果快速高效，對真菌殺滅性能較差，殺菌譜較窄。

在本研究中，多次皮膚刺激實驗結果顯示3種臨床消毒劑多次皮膚刺激性指數為0，刺激反應強度均為無刺激性，對人體安全無刺激。但在臨床使用時，應注意老人和兒童對75 %乙醇刺激性氣味的不耐受以及少數過敏體質人群使用乙醇消毒時產生的過敏反應。另外，乙醇易揮發，濃度受溫度的影響較大，殺菌效果也會受到影響，盡量做到現配先用，隨用隨配。目前，張鵬等[13]認為高濃度的三氯生能直接或間接影響人類的健康，但有研究[14]表明三氯生對于人類健康影響的研究不足，目前還缺乏對人體有效的安全評價的科學依據。所以，在臨床上使用三氯生消毒劑進行消毒時，應盡量配制低濃度的三氯生溶液，一般不超過0.3 %。

綜上所述，三氯生對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺滅效果最好，乙醇和碘伏對銅綠假單胞菌和白色念珠菌的殺菌效果優于三氯生，臨床上應根據患者情況和殺滅對象加以區別選擇。