PIK3CA及GST—π在人骨肉瘤中的表達(dá)及其臨床意義

丁萬(wàn)軍 黃莉 曾濤 戈偉 張煜坤 郭衛(wèi)春 余鈴

[摘要] 目的 檢測(cè)磷脂酰肌醇3激酶（PIK3CA）及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶π（GST-π）在骨肉瘤組織中的表達(dá)，探討其對(duì)骨肉瘤多藥耐藥的影響。 方法 收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院2009年1月～2017年6月33例骨肉瘤病理組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化方法（Envision法）及Western blot法測(cè)定PIK3CA、GST-π在骨肉瘤標(biāo)本中的表達(dá)。比較化療耐藥組（7例）和化療有效組（26例）中表達(dá)的差異，并結(jié)合臨床病理因素進(jìn)行分析。 結(jié)果 免疫組化檢測(cè)化療耐藥組和化療有效組的PIK3CA表達(dá)的平均吸光度值分別為（11.089±2.147）、（6.938±2.065），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；化療耐藥組和化療有效組GST-π表達(dá)的平均吸光度值分別為（15.871±2.678）、（7.693±2.443），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。Western blot法檢測(cè)兩組中PIK3CA和GST-π的蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。PIK3CA和GST-π在骨肉瘤組織中的蛋白表達(dá)具有相關(guān)性（r = 0.68，P < 0.01）。 結(jié)論 PIK3CA及GST-π在骨肉瘤化療耐藥組中高表達(dá)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，其可能是骨肉瘤耐藥的發(fā)生機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 骨肉瘤；磷脂酰肌醇3激酶；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶；多藥耐藥

[中圖分類號(hào)] R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）06（a）-0021-04

[Abstract] Objective To detect the expression of phosphatidylinositol 3-kinase （PIK3CA） and glutathione-S transferase-π （GST-π） in osteosarcoma tissues and to explore its effect on the multidrug resistance of osteosarcoma. Methods Thirty-three cases of pathological tissue specimens of osteosarcoma from Renmin Hospital of Wuhan University from January 2009 to June 2017 were collected. The expression of PIK3CA and GST-π of 33 cases of osteosarcoma specimens was detected by immunohistochemistry （Envision method） and Western blot method. The differences between the chemotherapy-resistant group （7 cases） and the chemotherapy-effective group （26 cases） were compared. The results were analyzed combined with clinicopathological factors. Results The average optical density of PIK3CA in the chemotherapy-resistant group and chemotherapy-effective group was （11.089±2.147） and （6.938±2.065） respectively， and there was a significant difference between the two groups （P < 0.05）； the average optical density of GST-π in the chemotherapy-resistant group and chemotherapy-effective group was （15.871±2.678） and （7.693±2.443）， and there was a significant difference between the two groups （P < 0.05）. The average optical density of PIK3CA and GST-π by Western blot method had significant differences between the two groups （P < 0.05）. The expression of PIK3CA and GST-π in osteosarcoma was correlated （r = 0.68， P < 0.01）. Conclusion PIK3CA and GST-π are over expressed in osteosarcoma chemotherapy-resistant group， and the expression of PIK3CA and GST-π is positively correlated with each other， which may be one of the mechanisms of drug resistance in osteosarcoma.

[Key words] Osteosarcoma； Phosphatidylinositol 3-kinase； Glutathione-S transferase； Multidrug resistance

骨肉瘤是最常見(jiàn)的骨惡性腫瘤之一，其發(fā)病部位以股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端最多見(jiàn)，發(fā)病年齡10～20歲占60%[1]。截肢術(shù)曾經(jīng)是骨肉瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療術(shù)式，但術(shù)后患者5年生存率不足20%[2]。隨著腫瘤化療的發(fā)展，化療聯(lián)合保肢手術(shù)是新興的治療骨肉瘤的有效策略，可促使患者5年生存率提高近50%[3-4]。對(duì)于晚期患者，化療是其主要治療手段。然而有部分骨肉瘤患者因多藥耐藥（MDR）而對(duì)化療不敏感，導(dǎo)致治療失敗，這是影響骨肉瘤患者愈后的主要原因之一[5]。因此近年來(lái)，關(guān)于骨肉瘤化療耐藥的機(jī)制及尋找逆轉(zhuǎn)化療耐藥的新的靶點(diǎn)或藥物，是骨肉瘤相關(guān)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)解毒系統(tǒng)增加化療藥物的外排是骨肉瘤化療耐藥的主要機(jī)制之一。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶π（glutathione-S-transferase-π，GST-π）是細(xì)胞內(nèi)解毒系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，也是目前已經(jīng)證實(shí)的與MDR產(chǎn)生有密切關(guān)系的蛋白[6]。PI3K/AKT信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)在人類多種腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)及浸潤(rùn)過(guò)程中起了十分關(guān)鍵的作用的信號(hào)通路，其在多種腫瘤中激活，參與腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、抵抗凋亡等多個(gè)環(huán)節(jié)。PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的Ⅰ類磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinases，PI3Ks）的p110催化亞單位PI3Kp110α是該信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白之一，其由PIK3CA基因編碼。因此，PIK3CA也是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)基因。隨著人們對(duì)PIK3CA基因及蛋白（PIK3Kp110α）的深入研究，發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的多藥耐藥中可能也起到重要作用[7]。在大腸癌中，PIK3CA高表達(dá)與其耐藥性相關(guān)。在骨肉瘤中，PIK3CA較正常組織高表達(dá)[8]，但其作用機(jī)制，特別是其與骨肉瘤化療耐藥的關(guān)系目前仍不明確。

本研究采用免疫組化Envision法和Western blot技術(shù)測(cè)定PIK3CA、GST-π在33例骨肉瘤組織中的表達(dá)，比較化療耐藥組和化療有效組中表達(dá)的差異，并結(jié)合臨床病理因素進(jìn)行分析，旨在探討骨肉瘤PIK3CA及GST-π表達(dá)與骨肉瘤化療多藥耐藥的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取武漢大學(xué)人民醫(yī)院2009年1月～2017年6月有化療前明確組織學(xué)病理診斷及化療后療效評(píng)估的的骨肉瘤組織標(biāo)本33例，其中男15例，女18例；年齡9～40歲，平均（18.7±4.6）歲；發(fā)病部位：股骨下端12例，脛骨上端9例，股骨上端4例，肱骨上端3例，股骨干3例，腓骨上端2例；Enneking分期：ⅡA期16例，ⅡB期6例，ⅢA期4例，Ⅳ期7例；8例為晚期姑息性化療，25例為術(shù)前新輔助化療，化療采用MAID方案，具體方案如下：美司那1500 mg/m2 CIV第1～4天，阿霉素20 mg/m2 CIV第1～3天，異環(huán)磷酰胺2500 mg/m2 CIV第1～3天，達(dá)卡巴嗪 300 mg/m2 CIV第1～3天，每21天重復(fù)。新輔助化療或姑息化療2個(gè)周期后按RECIST標(biāo)準(zhǔn)行療效評(píng)價(jià)。

1.2 化療療效評(píng)估和分組

該研究每位患者均有術(shù)前化療的影像學(xué)基礎(chǔ)評(píng)估，2個(gè)周期新輔助化療或姑息化療后，根據(jù)影像學(xué)變化（CT和/或MRI），選取目標(biāo)病灶進(jìn)行化療療效評(píng)價(jià)。化療療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)采用歐洲腫瘤年會(huì)制訂的關(guān)于實(shí)體腫瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)RECIST1.1版進(jìn)行[9]。①完全緩解（CR）：所有目標(biāo)病灶消失；②部分緩解（PR）：基線病灶長(zhǎng)徑總和縮小>30%；③疾病進(jìn)展（PD）：基線病灶長(zhǎng)徑總和增加>20%或出現(xiàn)新病灶；④穩(wěn)定（SD）：基線病灶長(zhǎng)徑總和有縮小但未達(dá)PR或有增加但未達(dá)PD[9]。化療有效包括CR、PR及SD患者，化療耐藥指PD患者。據(jù)此療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)將33例患者分為化療有效組（26例）和化療耐藥組（7例）。

1.3 試劑

兔抗人PI3Kinase p110α抗體濃縮液購(gòu)自Cell Signaling Technology公司（工作濃度1∶100），鼠抗人GST-π單克隆抗體、通用型二抗以及其他輔助試劑均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化檢測(cè) 嚴(yán)格按照Max VisionTM法染色程序進(jìn)行免疫組化步驟操作：首先二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，然后用3%過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，檸檬酸高壓加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，加一抗后4℃過(guò)夜，PBS沖洗后滴加二抗，室溫孵育20 min，然后二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。PIK3CA蛋白以已知陽(yáng)性表達(dá)的腦組織作陽(yáng)性對(duì)照，GST-π用已知陽(yáng)性的乳腺癌為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。Carestream軟件顯微鏡采圖后，用Imagepro圖像分析軟件檢測(cè)平均吸光度值。

1.4.2 Western blot法檢測(cè) 從骨肉瘤組織中提取總蛋白，每孔道加入50 μg蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳電壓100 V，共2～3 h電泳結(jié)束后進(jìn)行PVDF膜轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜成功后置于5%脫脂奶粉封閉液中，37℃封閉2 h，然后用PBST洗膜后分別加入一抗PI3Kp110α和GST-π及β-actin，一抗按1∶10 000稀釋，4℃過(guò)夜。第2天用PBS洗膜后加通用型二抗，均按1∶5000稀釋，37℃孵育1 h，洗膜后ECL曝光，曝光后的膠片依次顯影、定影，室溫晾干、掃描，用Carestream軟件顯微鏡采圖后用Imagepro圖像分析軟件分析Western blot印跡結(jié)果中目的蛋白條帶和相應(yīng)內(nèi)參條帶的凈吸光度值，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值作為目的蛋白的相對(duì)灰度值。

1.4.3 免疫組化結(jié)果判定 PIK3CA、GST-π陽(yáng)性表達(dá)在胞質(zhì)，以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)志，高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野或1000個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性，否則為陰性。同時(shí)用Carestream軟件顯微鏡采圖后，用Imagepro圖像分析軟件檢測(cè)平均吸光度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，PIK3CA和GST-π表達(dá)的相互關(guān)系用Pearson相關(guān)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Envision法檢測(cè)結(jié)果

化療有效組PIK3CA和GST-π的平均吸光度值明顯低于化療耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖1（封三）、表1。

2.2 Western blot法檢測(cè)結(jié)果

化療有效組PIK3CA和GST-π蛋白表達(dá)的平均吸光度值明顯低于化療耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖2、表2。

2.3 PIK3CA和GST-π的相關(guān)性分析

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，PIK3CA和GST-π在骨肉瘤組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.68，P < 0.01）。見(jiàn)表3。

3 討論

骨肉瘤是發(fā)病率最高的原發(fā)骨惡性腫瘤，過(guò)去的主要治療手段是采取截肢手術(shù)，然而術(shù)后患者容易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后極差。近年來(lái)隨著骨肉瘤化療的發(fā)展，患者的總體預(yù)后得到了極大的改善，化療聯(lián)合手術(shù)成了目前的標(biāo)準(zhǔn)治療模式。但有部分骨肉瘤患者存在MDR，這是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要原因之一，并已經(jīng)成為影響這部分骨肉瘤患者預(yù)后的重要因素。根據(jù)Krishna等曾作出的分類標(biāo)準(zhǔn)可將MDR分為兩類——典型抗藥機(jī)制與非典型抗藥機(jī)制。典型機(jī)制中多藥耐藥相關(guān)蛋白及P-糖蛋白（P-gp）起主要抗藥作用，在非典型機(jī)制中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶等在多藥耐藥中起主要作用[10]。

GSTs是同源二聚體酶超基因家族的一種，有θ、μ、α、π等多種同工酶，其N端谷胱甘肽的結(jié)合位點(diǎn)含有酪氨酸殘基，其羥基可以與硫醇化谷胱甘肽形成氫鍵，在催化反應(yīng)中有重要作用，C端為親電子結(jié)合區(qū)，為底物結(jié)合位點(diǎn)[11]。GST-π催化GSH的巰基能和多種體內(nèi)或者體外來(lái)源的親電化合物結(jié)合，結(jié)合后形成極性較大的復(fù)合物，這些復(fù)合物可以被多藥耐藥蛋白（MRP）和P-gp等泵出體外，從而實(shí)現(xiàn)GST-π的解毒作用。但同時(shí)，大多數(shù)化療藥物也可被GST-π催化和GSH結(jié)合形成GSH-藥物復(fù)合物，同樣易被MRP泵出體外，使抗腫瘤藥物在體內(nèi)作用時(shí)間變短，不能有效發(fā)揮作用，導(dǎo)致臨床上發(fā)生嚴(yán)重的腫瘤細(xì)胞MDR[11-12]。GST-π除了通過(guò)直接的細(xì)胞解毒，還可以抑制凋亡的MARK通路，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致耐藥[13]。本研究應(yīng)用免疫組化法對(duì)骨肉瘤組織中GSTs的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在化療耐藥組中GSTs表達(dá)的吸光度值顯著高于化療有效組（P < 0.01）；同時(shí)采用Western blot方法檢測(cè)了兩組GSTs在骨肉瘤組織中的表達(dá)也得到同樣結(jié)果，以上結(jié)果提示GSTs的表達(dá)與骨肉瘤化療MDR有關(guān)，但GSTs表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不明確。

PIK3CA基因定位于染色體3q26.3，長(zhǎng)34 kb，其包含21個(gè)外顯子。PIK3CA基因編碼Ⅰ類磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinases，PI3Ks）的p110催化亞單位，即PI3Kp110a。PI3Kp110a具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性，促使絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）活化，活化的AKT磷酸化多種底物參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化以及遷移等有關(guān)的信號(hào)通路，因此PI3K/AKT通路在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。PIK3CA的突變約4/5發(fā)生在螺旋區(qū)（exon9）和激酶區(qū)（exon20）這兩個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，其突變不僅可以減少細(xì)胞的凋亡，還可以促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)，提高其下游激酶PI3Ks的活性，及導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路的激活[14-16]。PI3K/Akt信號(hào)通路作為細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和抗凋亡的重要調(diào)節(jié)因素，近年來(lái)研究表明其與腫瘤耐藥關(guān)系也十分密切[17-19]。張棟等[16]發(fā)現(xiàn)卵巢癌DDP耐藥機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路異常有關(guān)，并且證實(shí)通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路能增強(qiáng)卵巢癌對(duì)DDP的敏感性。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活使得結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的耐藥性明顯增加。Gobin等[20]發(fā)現(xiàn)，PI3K由于其突變頻率高和/或其在癌細(xì)胞中的催化亞基功能增加，而成為骨肉瘤增殖轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制。但目前有關(guān)PIK3CA與骨肉瘤耐藥關(guān)系研究極少，本研究以人骨肉瘤為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)與化療有效組相比，化療耐藥組細(xì)胞的PIK3CA的陽(yáng)性表達(dá)吸光度值明顯增高。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CA與GSTs的表達(dá)具有相關(guān)性，提示PIK3CA可能通過(guò)調(diào)控GSTs的表達(dá)影響骨肉瘤的化療敏感性。

綜上所述，在化療耐藥組中PIK3CA及GST-π陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于化療有效組，提示PIK3CA及GST-π可能參與骨肉瘤多藥耐藥過(guò)程。同時(shí)PIK3CA與GST-π的表達(dá)呈正相關(guān)，提示PIK3CA可能是人骨肉瘤GST-π介導(dǎo)的多藥耐藥的關(guān)鍵機(jī)制之一。本研究的不足之處在于，未進(jìn)一步驗(yàn)證PIK3CA及GST-π對(duì)人骨肉瘤耐藥的調(diào)控及機(jī)制。

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